摘要
目的： 肠道病毒71型(EV71)是手足口病的主要病原体之一，由EV71引起的手足口病大部分表现为轻微症状，但仍有部分患者的病情进展为重症神经系统疾病，并引起脑干脑炎，急性弛缓性麻痹，肺水肿和心肺功能衰竭，有较高的病死率。由于目前没有有效预防或治疗EV71的药物和疫苗，虽有进入临床试验的药物或疫苗，但很难广泛应用于人群，仍需继续对EV71感染的机制进行深入研究以探索新的针对EV71的药物靶点。 细胞自噬(autophagy)是在真核生物中高度保守的过程，降解长寿命蛋白及衰老细胞器以实现再循环利用，发生在细胞正常生长发育、分化的生理过程中，病原体感染时也会引起自噬的发生。由于在免疫过程中的作用，自噬往往被病原体所利用以逃逸免疫，自噬体膜也可能被病原体重构以利于其复制。相关研究通过体内外实验证明了EV71感染可诱导自噬并促进EV71复制，但其具体分子机制仍未明确。EV71病毒的VP1蛋白位于病毒最外部的部分，能够结合宿主细胞表面受体来协助病毒感染，具有重要的研究意义，VP1蛋白与宿主细胞蛋白存在复杂的相互作用。因此，本研究考虑VP1蛋白可能参与了EV71诱导自噬的调控机制。故提出猜想:EV71病毒通过其VP1蛋白参与自噬的调控和执行过程。 方法： 1.EV71诱导的自噬的检测 采用Western Blot技术，检测自噬的生物标志物LC3的转化;构建RD-GFP-RFP-LC3细胞株，通过荧光显微镜对荧光自噬颗粒进行检测。使用qPCR技术检测自噬抑制后的病毒含量，验证EV71病毒复制过程是否需要自噬。 2.构建EV71VP1表达载体，探索VP1蛋白是否参与EV71诱导的自噬 将VP1蛋白构建于pEGFP-N1，在表达载体转染后，采用qPCR技术检测自噬相关的基因，采用Western Blot技术检测自噬相关蛋白，验证EV71VP1蛋白是否参与EV71诱导自噬的调控机制。 3.筛选与VP1蛋白存在相互作用的自噬相关蛋白，并探索其在病毒复制中的作用 联合免疫共沉淀技术及质谱技术，筛选与EV71VP1病毒存在相互作用的自噬相关蛋白;随后设计合成相关蛋白的siRNA，沉默相关蛋白的表达，采用qPCR技术检测病毒的含量变化。 结果： 1.RD-GFP-RFP-LC3细胞构建成功，在EV71感染后可观察到绿色和红色的自噬荧光颗粒。Western Blot检测结果显示以MOI=1感染细胞，在感染后12、24、48h，LC3Ⅱ的含量均高于对照组;在EV71感染48h后，自噬相关蛋白ATG4B、ATG5、ATG7的蛋白含量增加，而在加入自噬抑制剂3-MA后含量减少。 2.qPCR检测病毒含量显示，应用自噬抑制剂3-MA后，细胞内病毒的复制在0h、6h、12h、24h分别减少3.9倍、48.7倍、18.1倍、9.3倍，24h上清病毒含量减少8.3倍(p＜0.05);应用自噬抑制剂LY294002后，9h和12h的细胞内病毒的含量减少3、2，2倍(p＜0.05)。 3.构建VP1表达载体，在表达载体转染后，qPCR检测显示与对照组相比，转染了pEGFP-N1-VP1后，ATG5在24h升高1.6倍，ATG7在24h时升高1.2倍(p＜0.05)，Western Blot检测显示与对照组和阳性对照pEGFP-N1组相比，转染了pEGFP-N1-VP124、48h后，LC3Ⅱ蛋白量较对照组的明显增加，而添加3-MA抑制自噬后，LC3Ⅱ蛋白量相对减少。在转染pEGFP-N1-VP124h时，自噬相关蛋白ATG4B、ATG5、ATG7的表达也较对照组增加，而添加3-MA抑制自噬后相对减少。 4.构建VP1分段表达载体，在表达载体转染后，Western Blot检测显示和pEGFP-N1相比，与pEGFP-N1-VP1一样，pEGFP-N1-VP1(6)可以引起LC3发生酯化，LC3Ⅱ明显增加。此外，ATG5的蛋白含量较pEGFP-N1、对照组增多。 5.联合免疫共沉淀技术及质谱技术，筛选出7个与VP1及VP1(6)均存在相互作用的蛋白，其中PHB2参与自噬。 6.针对PHB2设计合成siRNA，转染后感染病毒，qPCR检测显示与NC组相比，感染后12、24、48h细胞内PHB2含量减少约77％、52％、82％(p＜0.05)，细胞内病毒RNA含量减少57.6％(p＜0.05)。 结论： 1.EV71感染后可诱导自噬并促进病毒复制。 2.EV71病毒的VP1蛋白的尾部参与EV71病毒诱导自噬的过程。 3.EV71VP1蛋白能够通过其与PHB2的相互作用，参与自噬的调控或执行过程，促进病毒自噬的复制。
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