摘要
背景：蛋白质能量消耗（Protein-energy wasting，PEW）是慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease，CKD)的重要并发症，和患者心血管事件发病率及死亡风险密切相关。骨骼肌萎缩是诊断CKD-PEW最可靠的标准。CKD-PEW目前无特异性治疗方法，肾衰营养胶囊对CKD-PEW患者疗效显著，但作用机制不明，很难为中药的良好疗效提供理论依据。PEW骨骼肌萎缩的主要病理机制包括泛素-蛋白酶体系统、caspase-3和肌抑素的激活。近年来，越来越多的证据表明，氧化应激和自噬与CKD-PEW骨骼肌萎缩密切相关。活性氧(Reactive oxygen species，ROS)可以作为细胞信号分子启动自噬体的形成，自噬则通过去除蛋白质聚集物和受损的细胞器来减少氧化损伤，而过度自噬又进一步造成组织损伤。氧化应激和自噬相互作用，可能是参与PEW骨骼肌萎缩的重要因素。课题组最近研究发现，肾衰营养胶囊可以调节CKD大鼠氧化应激和自噬状态，同时改变骨骼肌中p-Akt、p-mTOR、CREB等相关蛋白的表达水平。目前尚无基于氧化应激和自噬探讨中药对PEW骨骼肌萎缩治疗作用的相关报道。 目的：以5/6肾切除模型大鼠和肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-alpha，TNF-α)诱导的C2C12骨骼肌细胞为研究对象，通过体内和体外实验明确肾衰营养胶囊对CKD-PEW骨骼肌萎缩的治疗作用，探讨其对氧化应激和自噬的影响，并研究相关分子机制，阐明肾衰营养胶囊改善CKD-PEW骨骼肌萎缩的作用途径。 方法：通过5/6肾切除方法建立CKD大鼠模型，设置假手术组（Sham）、模型组(Model)、肾衰营养胶囊(SSYYJN)干预组和开同(KA)对照组。以血清肌酐(Scr)、血尿素氮（BUN）、24h尿蛋白、炎症因子等作为CKD的疗效评价标准，以血清白蛋白（Serum albumin，ALB）、体重、肌肉质量、骨骼肌横截面积等作为改善PEW和骨骼肌萎缩的评价指标，并通过检测肾衰营养胶囊对TNF-α诱导的C2C12小鼠成肌细胞增殖和凋亡的影响，明确肾衰营养胶囊对CKD-PEW骨骼肌萎缩的治疗作用;以ROS活性、线粒体形态、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)水平为标准，检测肾衰营养胶囊对CKD大鼠和TNF-α诱导的C2C12成肌细胞氧化应激水平的影响;通过电镜检测骨骼肌组织中自噬小体(autophagosomes，APs)、自噬溶酶体(autolysosome，ALs)数目，通过蛋白质印迹法(Western blotting，WB)检测p62和LC3-Ⅱ蛋白的表达水平，探讨肾衰营养胶囊对自噬的影响;最后通过检测CKD大鼠骨骼肌和C2C12细胞中磷酸化磷酸肌醇3激酶(Phosphoinositide3-kinase，p-PI3K)、p-Akt、p-mTOR、环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)、自噬相关蛋白7(autophagy related7，Atg7)、自噬相关蛋白5(autophagy related5，Atg5)等蛋白的表达，并通过在C2C12细胞系中构建Nox2高表达稳定株，反向验证肾衰营养胶囊对氧化应激和自噬的调节作用，阐明肾衰营养胶囊对CKD-PEW的作用机制。 结果：体内实验表明肾衰营养胶囊干预后，CKD大鼠Scr、BUN、24h尿蛋白及炎症因子水平较Model组显著降低;大鼠体重、骨骼肌重量、ALB水平较Model组显著增加，其治疗效果和开同组无明显差异;HE结果显示，肾衰营养胶囊干预后，CKD大鼠的骨骼肌体积和横截面积较Model组有所增加;体外实验表明，肾衰营养胶囊含药血清干预组可以减轻TNF-α诱导的C2C12细胞凋亡，促进C2C12细胞增殖。肾衰营养胶囊治疗组线粒体损伤程度较Model组显著减轻，CKD大鼠骨骼肌中Aps和ALs的数目均较Model组减少。同时，体内体外实验均表明，肾衰营养胶囊可以减少ROS含量，增强CKD状态下SOD、GSH-Px、CAT活性，降低MDA水平，并且在减少LC3蛋白表达量的同时增强p62蛋白的表达。基于肾衰营养胶囊作用机制的研究表明:肾衰营养胶囊干预后，CKD大鼠骨骼肌组织和C2C12细胞中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白水平较模型组升高，但自噬相关蛋白CREB、Atg5、Atg7表达水平较模型组降低;在高表达Nox2的C2C12成肌细胞稳定株中，肾衰营养胶囊对p-PI3K、p-Akt、p-mTOR及自噬相关蛋白CREB、Atg5、Atg7的调节作用减弱。 结论：肾衰营养胶囊通过调节PI3K/Akt/mTOR/CREB信号通路，减轻5/6肾切除模型大鼠和TNF-α诱导的C2C12细胞氧化应激和自噬水平，改善CKD-PEW骨骼肌萎缩。
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