摘要
目的: 糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一种代谢疾病，其特点是胰岛素分泌绝对不足或者相对不足引起的高血糖症，中医辩证为“消渴症”。青钱柳叶(Cyclocarya paliurus，CP)具有清热消肿解毒的功效，近年来其降血糖、降血压等作用引起了人们的关注。中医辩证消渴症一般分为阴虚燥热、阴虚内热、气阴两虚和阴阳两虚四种类型，其中阴虚内热型是最常见的一种。本论文通过高脂饲料+甲状腺素(Thyroxin，T4)+多次小剂量注射链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)建立阴虚内热型糖尿病大鼠模型，并观察青钱柳叶水提物治疗阴虚内热型糖尿病的作用，初步探讨其作用机理。为中药青钱柳叶用于阴虚内热型糖尿病的治疗提供更多的实验依据。 方法: 一、模型制备 SD大鼠，给予高脂饲料喂养（正常组给予普通饲料），第3周，除正常组外，每组动物均皮下注射T40.2mg/kg/d，连续7天。第4周，腹腔注射25mg/kg STZ溶液;正常组腹腔注射同等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。注射STZ后第3天，动物禁食测空腹血糖(Fasting blood glucose，FBG)，以FBG≥7.8mmol/L及出现阴虚内热表征作为阴虚内热型糖尿病大鼠模型建立标准。 二、分组及给药 将造模动物随机分为模型组，阳性组(知柏地黄丸组(1.5g/kg/d)、二甲双胍组(0.125g/kg/d))，青钱柳叶水提物高（26.4mg/kg/d）、中(13.2mg/kg/d)、低(6.6mg/kg/d)剂量组。灌胃给药4周（1天/次）。正常组，模型组给予等体积的蒸馏水。给药期间，模型组及给药组继续饲以高脂饲料，正常组饲以普通饲料。 三、指标检测 （一）阴虚内热症状检测 1.表观指标:每周记录动物表征，动物行为、背部温度、眼睛神采、舌颜色、爪色、大便干硬情况。 2.对阴虚症的改善作用:末次给药后，测血清中三碘甲状腺原氨酸(Triiodothyronine，T3)、T4、环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、环磷酸鸟苷(Cyclic guanosine monophosphate，cGMP)水平。 3.对免疫功能的影响:末次给药后，取全血测定淋巴细胞亚群CD3、CD4和CD8水平。 （二）糖尿病大鼠一般情况 造模成功后，每周测定动物体重、摄食量、饮水量、尿量。 （三）对肝功、肾功的影响 末次给药后，测定血清中谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)、AST/ALT、尿素氮（Carbamide）、肌酐(Creatinine，Cre)水平。解剖取肝脏、肾脏，计算肝肾系数;取肝脏组织，HE染色观察其病理形态的改变。 （四）糖脂代谢检测 1.造模成功后，每周定期测定FBG水平。 2.末次给药后，测定动物口服糖耐量(Oral glucose tolerance test，OGTT)、糖化血红蛋白水平、取肝脏组织，检测肝糖原含量。 3.末次给药后，放免诊断试剂盒测血清胰岛素(insulin，INS)水平，并计算胰岛素敏感指数（Insulin sensitivity index，ISI）及胰岛素抵抗指数(Homeostasis model assessment for insulin resistance,HOMA-IRI)。 4.末次给药后，测血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、FFA的含量。 （五）对InsR、IRS-2基因表达的影响 Q-PCR测定肝脏组织中胰岛素受体(insulin receptor，InsR)、胰岛素受体底物(insulin receptor substrate-2，IRS-2)的基因表达。 结果: 一、阴虚内热型糖尿病模型大鼠建立 造模后，大鼠出现明显的阴虚内热表现:活动次数增加、背部温度增加、舌色鲜红、爪色青紫、大便干硬、眼睛神采变暗（P＜0.01或P＜0.05）;大鼠T3及cGMP水平明显升高，免疫功能异常（淋巴细胞亚群CD3+、CD4+和CD8+水平紊乱）（P＜0.01或P＜0.05）。且模型动物体重明显减轻，摄食量、饮水量和尿量均明显增加（P＜0.01或P＜0.05）;空腹血糖明显升高，口服糖耐量异常，肝糖原明显降低(P＜0.01或P＜0.05);胰岛素含量明显升高，ISI明显降低，HOMA-IR明显升高，表现为明显的胰岛素抵抗（P＜0.05），提示造模成功。 二、青钱柳叶水提物对模型大鼠的阴虚症状的改善作用 （一）阴虚内热表观指标:与模型组相比，在给药第四周时，青钱柳叶水提物各剂量组动物背部温度上升程度、舌色鲜红比率及爪色青紫程度均有所改善;活动次数有所减少、眼睛神采好转(P＜0.01或P＜0.05)。 （二）cAMP、cGMP、T3、T4:给药各剂量组能明显降低cAMP的含量（P＜0.01或P＜0.05），对cGMP、cAMP/cGMP比值以及T3、T4无明显影响。 （三）免疫功能指标:青钱柳叶水提物低剂量组能显著性降低CD4+/CD8+的数值（P＜0.05或P＜0.01）;CD3+、CD4+、CD8+均无明显差异。 三、青钱柳叶水提物对模型大鼠糖尿病指标改善作用 （一）体重、摄食量、饮水量、尿量的变化 与模型组动物相比，青钱柳叶水提物能显著性降低动物摄食量、饮水量、尿量（P＜0.01或P＜0.05）;对体重无明显影响。 （二）肝、肾功能的影响 与模型组相比，青钱柳叶水提物各给药组均能明显降低血清中尿素氮的含量（P＜0.01）;中、低剂量组肝脏系数显著性增加(P＜0.01);其余各指标无明显差异;各给药组能改善肝脏的病理形态的损伤。 （三）糖脂代谢方面 1.给药第二周起，青钱柳叶高、低剂量组均能显著降低动物的FBG(P＜0.01或P＜0.05)。 2.给药第四周后，高、低剂量组均能显著降低OGTT。 3.青钱柳叶水提物中剂量组能显著性降低INS含量(P＜0.05);显著性增加ISI（P＜0.05）、降低HOMA-IRI(P＜0.05)。 4.本实验中青钱柳叶水提物对脂代谢无明显影响。 四、青钱柳叶水提物对模型大鼠肝脏组织InsR、IRS-2基因表达的影响 青钱柳叶各剂量组均能显著性增加InsR、IRS-2mRNA表达水平。 结论: 通过高脂饲料+甲状腺素+STZ的方法，可成功建立阴虚内热型糖尿病大鼠模型;青钱柳叶水提物能改善模型动物的阴虚内热证候、“三多一少”症状及肝脏的病理形态的损伤程度;空腹血糖、口服糖耐量、AUC、胰岛素抵抗均有明显改善，其作用机制可能与增加肝脏内InsR、IRS-2表达有关。
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