摘要
骨移植术是通过手术方式植入材料来增加骨再生的最常见的外科手术之一，是仅次于输血的组织移植术，普遍用于因肿瘤外科治疗等因素导致的骨缺损。全球范围内，每年有超过两百万的骨移植术被实施。因此，研究骨缺损后重建和恢复意义重大。 研究证明，锶可促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞形成和吸收，同时还有助于体外胶原合成。因此，含锶骨替代材料有可能在预期位置刺激骨生长。本研究采用共沉淀法和水热法制备了新型的含锶硫酸钙，并建立了SD大鼠胫骨骨缺损模型。此外，证实了不同含量的含锶硫酸钙对骨修复的影响和作用机制。 目的: 1.体外探讨新型骨替代材料含锶α-半水硫酸钙浸提液对骨髓间充质干细胞(BMSC)的影响; 2.构建SD大鼠胫骨临界性骨缺损模型，并进行含锶α-半水硫酸钙材料移植入，检测对骨生成的影响; 3.收集缺损模型后含锶α-半水硫酸钙材料治疗后的胫骨，行病理等基础检测，检测对骨生成及信号通路的影响。 方法: 1.培养骨髓间充质干细胞，0％，5％，10％含锶硫酸钙浸提液处理1、3、7后天，MTT法和软琼脂克隆法检测BMSCs增殖能力;AnnexinⅤ/PI双染检测细胞凋亡能力;Transwells实验检测BMSCs侵袭能力;茜素红染色检测细胞成骨分化能力。机制上，qRT-PCR实验检测Runx2、Osterix、ALP、OCN和BSP表达水平;western blot实验检测TGF-β、Smad2/3和β-catenin表达水平。 2.全身麻醉采用肌肉注射3％戊巴比妥钠，体重30mg/kg。切开胫骨近端皮肤，逐层深入，随后用骨膜剥离子剥离骨膜，露出胫骨干。采用尖端0.8mm钻头从单侧胫骨的内侧皮质关节下制造骨缺损（长5mm，宽3mm），用生理盐水冲洗缺损和髓内管，清除残余骨和骨髓。建立骨缺损动物模型。并将SD大鼠分为4组:骨缺损组;硫酸钙组;5％含锶α-半水硫酸钙组;10％含锶α-半水硫酸钙组。不同材料植入SD大鼠胫骨缺损部位后，microCT观察骨重建状态;测量相对骨体积(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨密度(BMD)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁分离度(Tb.Sp);X光检查各组SD大鼠胫骨缺损恢复重建情况。 3.骨缺损模型经材料干预后，收集骨缺损位段胫骨段，HE染色和Masson染色不同植入材料对SD大鼠胫骨缺损修复的作用;qRT-PCR实验检测不同植入材料对胫骨缺损段Runx2，Osterix，ALP，OCN，BSP mRNA表达水平;western blot实验检测Smad2/3、p-Smad2/3、TGF-β、β-catenin和p-β-catenin表达水平;免疫组化检测植入不同材料8周后的骨组织中OCN表达。 结果: 1.骨髓间充质干细胞在25％的浸提液浓度下，各材料（10％以内锶含量）对细胞增殖能力影响无显著差异，表明材料对细胞毒性较小;细胞凋亡水平无显著差异;随含锶硫酸钙含量增加，成骨能力随之得到显著加强;Runx2、Ostenix、ALP、OCN、BSP表达水平亦随含锶硫酸钙含量增加而升高，同时，TGF-β/Smad2/3通路受到含锶硫酸钙激活。 2.microCT和X光透视结果表明，空白组大鼠骨缺损恢复情况较材料植入大鼠差，同时，随含锶硫酸钙含量增加，恢复情况趋好，其中10％含锶硫酸钙材料植入组效果最理想;分析结果显示，5％和10％含锶硫酸钙材料植入后，大鼠相对骨体积或骨体积分数显著优于空白组和硫酸钙组。 3.骨缺损空白组缺损位置恢复情况差，胶原纤维合成少，骨钙素含量表达低;材料植入后，显著改善了骨重建;同时，随着锶含量的增加，恢复情况越好，胶原纤维合成增多，骨钙素表达也增加。其中，尤以10％锶含量的含锶硫酸钙恢复情况最佳;最后，TGF-β/Smad2/3表达随着锶含量的增加而上调。 结论: 1.体外实验表明，一定范围内，随锶含量增加，促成骨能力增强;含锶硫酸钙在体外能够通过TGF-β/Smad2/3分子信号通路促进成骨分化。 2.体内实验表明，10％含锶α-半水硫酸处理后骨修复情况最好。具体表现为骨密度增加，缺损位置胶原纤维合成上升，骨钙素表达上调，TGF-β/Smad2/3表达上调。 3.5％和10％锶含量的含锶硫酸钙新型材料对骨缺损有显著的恢复改善作用。
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