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KMT2D通过PTEN/PI3K/AKT通路调控胃癌细胞的增殖能力
邓镇轩1
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摘要
胃癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，不同国家的胃癌发病率也是不完全相同的，但在发展中国家（尤其是中国）的胃癌患者明显多于其他国家。目前，对于胃癌的治疗仍然是以根治性切除术为主、以放化疗为辅的综合治疗方案。随着消化内镜技术和外科手术的快速发展，胃癌患者的生存率得到了很大的改善。然而，在中国胃癌的发病率依然居高不下，这很大程度是基因突变和表观遗传学改变的累积所造成的。此外，还有一部分原因是部分患者（尤其是进展期胃癌患者）在传统治疗方案下有效率比较低。因此，探索新的胃癌生物标志物是势在必行的。 组蛋白赖氨酸甲基转移酶2D(KMT2D/MLL2)是表观遗传调控的关键分子，其主要负责催化H3K4(H3K4me1)的氨基甲基化。研究表明，KMT2D基因在某些癌症中表现为很高的突变频率。同时，KMT2D还作为多个基因的增强子，在多种信号通路（如P53，cAMP等）的表达调控中起着重要的作用。最重要的是，KMT2D还能有效地抑制淋巴瘤的发生和转移。此外，在结直肠癌、乳腺癌等多种实体肿瘤中，KMT2D对于其肿瘤细胞的增殖分化也是必不可少的。事实上，既往研究表明，敲低KMT2D基因的表达水平可以抑制肿瘤细胞的增殖能力、增强其的化疗敏感性。综上所述，KMT2D有望成为胃癌诊断和治疗的新的生物学标志物。KMT2D已经被证明在很多癌症的发生发展中担任着重要角色，但其与胃癌的关系尚不清楚，有待进一步研究。 本研究，首先进行分析KMT2D在胃癌中的表达水平，进而分析其与胃癌患者临床病理特征及预后的关系。此外，为了更好地理解KMT2D在胃癌发生发展中的作用机制，我们进一步研究分析了KMT2D对胃癌增殖、凋亡的影响，及其与PTEN/PI3K/AKT等信号通路中的关系。 第一部分 KMT2D在胃癌组织中的表达及临床意义 目的： 探索胃癌中KMT2D的表达水平与临床病理特征及预后的关系。 方法： 1、收集2008年1月到2011年1月行手术治疗的110例胃癌患者的组织标本，术后的组织标本经两名经验丰富的病理学家诊断。 2、用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测110例胃癌患者的癌组织及癌旁正常癌组织的KMT2D的表达。 3、通过免疫组织化学实验检测110例胃癌患者的癌组织及癌旁正常癌组织的KMT2D的表达。 结果： 1、KMT2D在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(30/40，75％，P＜0.05); 2、KMT2D的高表达与胃癌患者的肿瘤大小(P=0.005)、TNM分期(P=0.004)、淋巴结浸润(P=0.006)及淋巴结转移(P＜0.001)相关; 3、免疫组织化学结果显示，KMT2D蛋白主要定位于细胞核，在胃癌组织中表达程度高; 4、Kaplan-Meier分析表明，KMT2D高表达组患者的总生存时间(P=0.025)和无瘤生存时间(P=0.005)较低表达组者显著缩短。 结论： 胃癌组织中KMT2D的表达显著高于癌旁正常组织，且KMT2D与胃癌患者的预后不良相关。因此，KMT2D有望成为胃癌的预后和诊断的关键标志物。 第二部分 KMT2D对胃癌细胞增殖能力的影响 目的： 研究KMT2D对胃癌细胞增殖能力的影响 方法： 1、通过Western blot技术检测五种胃癌细胞株(BCG823、SGC-7901、MKN45、MGC823、HGC-27)及正常胃上皮细胞(GES-1)中KMT2D的表达情况。 2、通过慢病毒转染技术干扰SGC-7901及MKN45细胞中KMT2D的表达，培养一段时间后用嘌呤霉素筛选并鉴定KMT2D稳定低表达的细胞株; 3、敲低KMT2D基因的表达后，通过CCK-8、平板克隆形成实验及裸鼠皮下成瘤实验等体内及体外实验检测SGC-7901及MKN45细胞增殖能力的变化; 4、敲低KMT2D基因的表达后，流式细胞技术检测SGC-7901及MKN45细胞的凋亡水平; 5、敲低KMT2D基因的表达后，流式细胞技术检测SGC-7901及MKN45细胞的周期分布情况; 6、敲低KMT2D基因的表达后，Transwell实验检测SGC-7901及MKN45细胞迁移的变化; 7、敲低KMT2D基因的表达后，Western blotting检测PTEN/PI3K/AKT通路相关蛋白的表达水平。 结果： 1、Western blotting结果显示：KMT2D的表达水平在SGC-7901及MKN45胃癌细胞株的表达相对较高。 2、慢病毒转染SGC-7901及MKN45细胞后，Western blot结果显示胃癌细胞内的KMT2D表达明显下降(P＜0.001)。 3、敲低KMT2D基因的表达后，CCK-8、平板克隆形成实验及皮下成瘤实验结果一致显示：SGC-7901及MKN45细胞增殖受到显著抑制; 4、敲低KMT2D基因的表达后，SGC-7901及MKN45细胞的凋亡水平均发生显著上升(P＜0.01); 5、敲低KMT2D基因的表达后，SGC-7901及MKN45细胞均被阻滞于G2/M期; 6、敲低KMT2D基因的表达后，SGC-7901及MKN45细胞的侵袭、转移能力均未见统计学差异。 7、敲低KMT2D基因的表达后，KMT2D通过PTEN/PI3K/AKT信号通路促进胃癌细胞的增殖。 结论： 下调KMT2D的表达可以抑制胃癌细胞的增殖能力，诱导细胞发生凋亡，并将更多的胃癌细胞阻滞在G2/M期。综上所述，KMT2D可能是胃癌患者的一个重要的调控靶点。
关键词
胃癌/肿瘤增殖/组蛋白赖氨酸甲基转移酶2D/PTEN基因/磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/分子调节机制引用本文复制引用
授予学位
硕士学科专业
内科学（消化系病）导师
李明松学位年度
2019学位授予单位
南方医科大学语种
中文中图分类号
R73