摘要
人的一生中会连续地积累体细胞突变，这可能会导致正常体细胞转化为肿瘤。而随着体细胞突变的进一步积累，肿瘤内会产生极大的遗传异质性。肿瘤内高水平的异质性使得肿瘤内克隆结构非常复杂，这种特性的存在是导致肿瘤转移、复发以及治疗失败的决定因素，对个体化肿瘤治疗产生了极大的挑战。在这个文章中，我们整合了一些前沿的方法，包括平行地原代培养、多组学测序、以及微取样技术等，意在揭示不同分子水平上的肿瘤克隆演化，以及肿瘤和癌前病变组织中的体细胞突变的差异。 因为病人之间存在遗传多样性，同时肿瘤间，肿瘤内存在基因组、表观组、转录组等多个层面上的异质性，所以从大量的肿瘤基因组数据中揭示肿瘤发生发展相关的功能重要的变异仍然很困难。在我们的研究中，为了排除种系遗传背景差异的影响，我们对同一个肝癌(HCC)病人的原发和复发肿瘤的细胞进行平行地原代培养，并得到多个细胞克隆。这些能包含病人内肿瘤细胞多样性的细胞克隆被用于多组学测序和细胞表型的测定。我们检测了基因组序列、表观修饰和基因表达中的差异，并进一步推断这些细胞克隆的进化关系。首先，基于单核苷酸突变(SNV)的谱系进化关系与表观/转录谱的分支结构不同。然而，我们没有观察到样品特异突变基因与样品特异差异表达基因具有显著的重叠部分，暗示着病人内的SNV的遗传异质性并不会导致功能表型的多样性。第二，我们发现这些原代培养中的拷贝数变异（CNA），和基因体（而不是启动子）的DNA甲基化差异与基因表达的差异显著相关。在复发肿瘤的一个克隆中，我们对其CNA及DNA甲基化驱动的基因进行通路富集分析，显示这一克隆可能存在不同的细胞形态和成瘤能力，并且在体内体外的实验中验证了这一推断。我们系统的分析显示了，与SNV相比，CNA和表观修饰的改变更容易导致肿瘤内细胞子群体的表型多样性，建议在个体化肿瘤治疗中应该考虑针对基因剂量和表观修饰的新策略。此外，这些原代培养的亚克隆对于进一步研究肿瘤转移、复发以及药物反应也是非常好的模型。 很多HCC来源于肝硬化结节的恶性转化。解析与HCC并发的癌前再生性结节的遗传特征能够帮助我们理解HCC中的分子进化机制。比较同一病人中的结节和肿瘤细胞中的体细胞突变，能够显示肿瘤细胞是否经历了突变速率和突变特征的改变。为了检测肝硬化结节中的体细胞变异，并比较结节和同一组织肿瘤细胞的差异，我们对来自于一个肝癌病人的多个结节样品和两个肿瘤样品进行了全基因组测序。结果显示结节与肿瘤相比，具有更稳定的基因组。肿瘤中突变数目大约是结节中平均突变数目的4-6倍。通过构建这些样品的系统发育关系，我们发现肿瘤和结节样品之间是非共同起源的，表现出非线性的分离模式。并且每个肿瘤都存在共同祖先，而每个结节样品都是多克隆起源，说明了在癌前病变组织之中存在极大的遗传异质性和早期的克隆扩张。我们也观察到突变特征在肿瘤和结节中存在贡献度的差异。从进化关系上看，在肿瘤克隆扩张后期（肿瘤进化树的分支上），每次分裂的突变速率比结节中的突变速率要高（约为结节中的3倍）。 肿瘤内异质性是癌症治疗和个体化医疗的主要障碍，不同类型的细胞子群体会共存于一个肿瘤内，或一个病人的多发肿瘤之间。在我们实验室之前关于一例HCC的研究中，发现中性进化是导致肿瘤内高度遗传多样性的主要力量。为了深入研究肿瘤内/肿瘤间的进化驱动力，我们在本研究中，对同一病人的两个肿瘤进行三维立体高密度地精细取样，每个样本约含有3000个细胞。我们对这些样品进行了全基因组测序并检测体细胞变异，将检测到的遗传多样性用于构建肿瘤的克隆演化关系。在每个肿瘤的上百个样本中，我们验证了共有的和多态性的突变是否存在，以用来刻画肿瘤的3D克隆结构。从谱系进化关系上看，首先，两个肿瘤在进化关系上是独立起源的;第二，在每个肿瘤内，靠近外周的样品比内部的样品具有更长的支长，可能说明了在肿瘤的生长过程中内外部细胞具有不同的更新速率。接下来，我们将要进一步地检测肿瘤内的进化驱动力以及构建肿瘤的3D生长模型。
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