摘要
肠道对二肽和三肽的吸收一般都是通过小肽转运载体PepT1进行转运。PepT1是一个完整的膜蛋白，目前有关它的研究已经进入到营养和生物医学应用领域。近几年来，研究饥饿与日粮蛋白对小肽转运载体PepT1表达和活动的影响变得十分积极。本研究选择岩原鲤作为实验动物，通过常规PCR克隆PepT1cDNA片段，并使用实时荧光定量PCR技术，研究了岩原鲤PepT1基因的组织分布，以及饥饿和不同浓度外源蛋白处理岩原鲤对PepT1基因表达造成的影响，旨在获取相应条件下的表达模式信息。本论文主要由以下3部分组成： ⒈岩原鲤小肽转运载体PepT1cDNA片段克隆及序列分析。 将其它脊椎动物的PepT1cDNA全长序列进行多序列比对，选择保守区设计引物，PCR扩增目的片段，扩增产物割胶回收并进行TA克隆，测序。克隆所得岩原鲤PepT1cDNA片段长751bp，Genbank序列登录号GU138157（未发布），将克隆所得PepT1cDNA片段进行BLAST搜索，结果显示该片段与普通鲤鱼的序列同一性最高（97%），斑马鱼次之（87%）。推导氨基酸序列编码250个氨基酸残基，覆盖5个跨膜区。 ⒉岩原鲤小肽转运载体PepT1mRNA的组织分布。 选择18SrRNA、EF1α和RFL13α作为内参基因，运用实时荧光定量PCR技术（SYBRGreenⅠ荧光染料法）对岩原鲤11个组织（前肠，中肠，后肠，脾脏，眼，脑，肌肉，心，肾脏，鳃和肝脏）的PepT1mRNA表达水平进行相对定量。实验结果显示前肠和中肠PepT1mRNA的表达水平显著高于其余组织（P﹤0.05），其余组织PepT1mRNA均为低水平表达，无显著差异，而前肠PepT1mRNA表达水平又显著高于中肠（P﹤0.05）。 ⒊饥饿与外源蛋白对岩原鲤幼鱼前肠PepT1mRNA表达的影响。 这部分实验研究了饥饿和灌喂不同浓度大豆低聚肽（SOP）溶液对岩原鲤幼鱼前肠小肽转运载体PepT1mRNA表达的影响。①分别取禁食1d，3d，5d，7d，9d，11d，14d的岩原鲤幼鱼进行前肠PepT1mRNA表达水平检测，其中禁食1d设为对照组。结果发现在所有时间点中，禁食5d，岩原鲤前肠PepT1mRNA表达水平达到最高。②将100尾岩原鲤幼鱼随机分成4组（对照组，5%，20%，35%SOP溶液组），按2ml/100g体重的剂量进行灌喂，对照组灌喂蒸馏水代替SOP。灌喂后0.5h，1.5h，3.5h，7.5h，12h取样，每组随机取出5尾岩原鲤幼鱼用于检测SOP对其前肠PepT1mRNA表达水平的影响。结果显示灌喂后1.5h各组岩原鲤PepT1mRNA表达水平均无显著差异；3.5h，5%SOP组引起PepT1mRNA表达水平增加，与该时间点其余组差异显著（P﹤0.05）；7.5h，5%与20%SOP引起PepT1mRNA表达水平增加，与对照组差异显著（P﹤0.05）；12h，20%与35%SOP引起PepT1mRNA表达水平增加，与对照组差异显著（P﹤0.05）。这表明灌喂大豆低聚肽溶液后，能诱导小肽转运载体PepT1mRNA在前肠表达。
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