摘要
背景： 白癜风是由特异性CD8+T细胞介导的自身免疫性皮肤病。近年来，众多研究表明氧化应激也是参与白癜风发病的重要因素。我们前期研究证实氧化应激下的角质形成细胞在白癜风局部免疫中发挥重要调控作用，可诱导CXCL10、CXCL16等多种趋化因子分泌，招募表达趋化因子受体CXCR3、CXCR6的白癜风CD8+T细胞向皮损局部迁移，进一步特异性攻击黑素细胞。活化是CD8+T细胞实施特异性免疫杀伤的前提，然而，氧化应激条件下的角质形成细胞是否调控白癜风CD8+T细胞活化和功能，仍需进一步阐明。 IL-15是一种多效细胞因子，主要调控记忆CD8+T细胞、NK细胞等多种免疫细胞的活化、增殖、生存以及功能。越来越多的研究证实IL-15促进多种免疫细胞活化和加剧细胞毒作用，而且在多种自身免疫性疾病的发生和发展中发挥重要作用。最近有研究证实IL-15可诱导正常皮肤中的定植记忆CD8+T细胞活化，升高GzmB、PRF等毒性分子表达。效应记忆CD8+T细胞是白癜风特异性CD8+T细胞的主要组成部分，然而IL-15对白癜风效应记忆CD8+T细胞的具体作用和机制并不清楚。 细菌、病毒等病原微生物感染组织可激活TLRs等固有免疫模式识别受体，促进IL-15表达，进而调动免疫细胞清除病原体感染的细胞，发挥免疫防御作用。进一步研究发现人T淋巴细胞病毒I型(HTLV-I)感染T细胞后，可激活细胞中的核因子-κB(NF-κB)信号，促进IL-15转录和表达。炎性刺激也可诱导IL-15表达上调，研究发现LPS通过激活巨噬细胞NF-κB信号通路增强IL-15的转录和表达，因此NF-κB信号是调控IL-15表达的关键转录因子。最近，我们课题组发现氧化应激可诱导角质形成细胞NF-κB信号活化，促进CXCL16等趋化因子产生和分泌，从而迁移CD8+T细胞参与白癜风局部免疫。由此我们提出如下科学假设：氧化应激下角质形成细胞NF-κB信号的激活促进IL-15转录和表达，进而调控效应记忆CD8+T细胞活化和功能，启动白癜风异常免疫应答。 目的： 阐明氧化应激对角质形成细胞IL-15表达的调控及分子机制，明确角质形成细胞来源的IL-15在白癜风效应记忆CD8+T细胞活化中的作用及分子机制。 方法： 1.检测白癜风皮损周围组织IL-15和H2O2水平。qRT-PCR、ELISA明确白癜风皮损周围组织和健康人表皮中IL-15mRNA和H2O2表达水平及相关性；组织免疫荧光分析白癜风皮损周围组织和健康人表皮IL-15和8-OHdG表达及其相关性，分析白癜风皮损周围组织表皮IL-15表达和黑素细胞数量的相关性；组织免疫荧光证实白癜风表皮IL-15的主要来源。 2.检测白癜风皮损周围组织IL-15Rα和8-OHdG表达。组织免疫荧光检测白癜风皮损周围组织和健康人表皮IL-15Rα和8-OHdG表达及其相关性；分析白癜风皮损周围组织表皮IL-15Rα表达和黑素细胞数量的相关性；明确白癜风表皮IL-15Rα的主要来源。 3.检测白癜风患者血清IL-15和H2O2含量。ELISA分析白癜风患者和健康人血清IL-15和H2O2含量，明确白癜风患者血清IL-15与血清或皮损周围组织H2O2含量的相关性。分析白癜风患者血清IL-15水平与疾病严重度(VASI评分)相关性。ELISA测定进展期白癜风患者标准治疗前后的血清IL-15水平。 4.氧化应激促进NHEKs细胞IL-15表达和反向呈递的现象研究。qRT-PCR、WesternBlot检测不同浓度H2O2刺激下NHEKs细胞IL-15mRNA和蛋白表达；细胞免疫荧光测定不同浓度H2O2刺激下NHEKs细胞IL-15和8-OHdG表达；流式细胞术明确不同浓度H2O2刺激后NHEKs细胞膜IL-15表达。ELISA测定H2O2刺激下NHEKs培养上清IL-15分泌水平；然后，qRT-PCR、WesternBlot检测不同浓度H2O2刺激下NHEKs细胞IL-15RαmRNA和蛋白表达；细胞免疫荧光分析IL-15Rα和8-OHdG表达；流式细胞术测定H2O2刺激后NHEKs细胞膜IL-15Rα表达。最后，流式细胞术检测干涉IL-15Rα后NHEKs细胞膜IL-15表达水平；qRT-PCR、WesternBlot明确干涉IL-15Rα后NHEKs细胞中IL-15mRNA和蛋白表达；组织免疫荧光检测白癜风皮损周围组织表皮IL-15和IL-15Rα共定位情况。 5.氧化应激促进NHEKs细胞IL-15表达和反向呈递的机制研究：qRT-PCR检测H2O2刺激下NHEKs细胞NF-κBp65mRNA表达情况，WesternBlot、细胞免疫荧光分析H2O2刺激下NHEKs细胞磷酸化NF-κBp65表达及定位；组织免疫荧光检测白癜风皮损周围组织磷酸化NF-κBp65和IL-15表达；JASPAR数据库预测NF-κBp65与IL-15启动子结合位点，ChIP验证H2O2刺激下NHEKs细胞中NF-κBp65与IL-15启动子结合情况。然后，qRT-PCR、WesternBlot检测NF-κBp65siRNA对NHEKs细胞IL-15mRNA和蛋白表达的影响；流式明确H2O2刺激下干涉NF-κBp65后NHEKs细胞膜IL-15表达；ELISA检测H2O2刺激下干涉NF-κBp65后NHEKs细胞上清IL-15含量。最后，JASPAR数据库预测NF-κBp65与IL-15Rα启动子可能的结合位点，qRT-PCR、WesternBlot明确干涉NF-κBp65后NHEKs细胞IL-15RαmRNA和蛋白表达。 6.氧化应激NHEKs细胞活化CD8+TEMs细胞的现象研究。评价和建立NHEKs细胞与CD8+TEMs细胞共培养模型。然后，流式检测CD8+TEMs与正常NHEKs细胞共培养、CD8+TEMs细胞培养中加入CD3/CD28抗体、CD8+TEMs与氧化应激NHEKs细胞共培养中加入或不加入MHC-I类分子中和抗体对CD8+TEMs细胞CD69表达的影响；流式测定Transwell小室、氧化应激NHEKs细胞上清对CD8+TEMs细胞CD69表达的影响；流式明确CD8+TEMs细胞与氧化应激NHEKs细胞共培养中加入IL-15中和抗体或CD122中和抗体对CD8+TEMs细胞CD69、IFN-γ、GzmB及PRF表达的影响。 7.氧化应激NHEKs细胞IL-15反向呈递活化CD8+TEMs细胞的分子机制研究。流式检测CD8+TEMs与正常NHEKs细胞或氧化应激NHEKs细胞共培养后CD8+TEMs细胞p-STAT3、p-STAT5蛋白表达情况。流式测定托法替尼预处理对共培养CD8+TEMs细胞p-STAT3、p-STAT5蛋白的表达情况。最后，流式明确托法替尼预处理对共培养CD8+TEM细胞CD69、IFN-γ、GzmB及PRF表达情况。 结果： 1.白癜风皮损周围组织IL-15和H2O2水平明显升高。qRT-PCR、ELISA证实白癜风皮损周围组织表皮IL-15mRNA水平和H2O2含量明显高于健康人表皮，且白癜风皮损周围组织表皮IL-15mRNA水平与表皮H2O2含量呈正相关；组织免疫荧光显示皮损周围组织表皮IL-15和8-OHdG荧光强度均明显高于正常表皮，且皮损周围组织表皮IL-15荧光强度与8-OHdG荧光强度正相关；组织免疫荧光结果发现皮损周围组织表皮IL-15荧光强度与表皮黑素细胞数量呈负相关，皮损周围组织表皮IL-15的主要来源是角质形成细胞。该部分结果说明白癜风皮损周围组织表皮IL-15升高与局部氧化应激相关，提示角质形成细胞来源的IL-15可能是关联氧化应激和白癜风异常免疫的桥梁分子。 2.白癜风皮损周围组织IL-15Rα和8-OHdG表达明显升高。组织免疫荧光显示白癜风皮损周围组织表皮IL-15Rα和8-OHdG荧光强度均明显高于正常表皮，且皮损周围组织表皮IL-15Rα与8-OHdG荧光强度呈正相关；组织免疫荧光证实皮损周围组织表皮IL-15Rα荧光强度与表皮黑素细胞数量呈负相关，皮损周围组织表皮IL-15Rα的主要来源是角质形成细胞。该部分结果提示白癜风皮损周围组织表皮IL-15Rα升高与局部氧化应激相关。 3.白癜风患者血清IL-15和H2O2水平显著升高。ELISA结果显示白癜风患者血清IL-15和H2O2含量显著高于健康人，白癜风血清IL-15含量不仅与血清H2O2水平正相关，而且和白癜风皮损周围组织表皮H2O2含量呈正相关。白癜风患者血清IL-15含量与VASI评分、治疗反应密切相关。该部分结果提示白癜风患者血清IL-15水平升高与氧化应激相关，因此血清IL-15水平可作为评价白癜风严重度和治疗反应的生物学指标。 4.氧化应激促进NHEKs细胞IL-15表达和反向呈递。qRT-PCR、WesternBlot及细胞免疫荧光证实H2O2升高NHEKs细胞IL-15mRNA和蛋白表达。流式结果显示H2O2可升高NHEKs细胞膜IL-15表达，提示氧化应激促进IL-15反向呈递。ELISA结果显示H2O2也可促进NHEKs分泌IL-15。然后，qRT-PCR、WesternBlot和细胞免疫荧光结果说明H2O2升高NHEKs细胞IL-15RαmRNA和蛋白表达；流式证实H2O2增加NHEKs细胞膜IL-15Rα表达，进一步干涉IL-15Rα可抑制NHEKs细胞膜IL-15表，qRT-PCR、WesternBlot显示干涉IL-15Rα不影响NHEKs细胞IL-15表达，因此IL-15Rα参与氧化应激诱导IL-15反向呈递，而不参与IL-15表达调控。免疫荧光结果显示白癜风皮损周围组织IL-15-IL-15Rα复合体表达明显多于正常表皮，在体证实了白癜风氧化应激微环境中IL-15-IL-15Rα复合体的形成。 5.氧化应激活化NF-κBp65通路促进NHEKs细胞IL-15表达及其反向呈递。qRT-PCR、WesternBlot显示H2O2升高NHEKs细胞NF-κBp65mRNA和蛋白表达，NF-κBp65磷酸化水平也显著升高；细胞免疫荧光证实H2O2不仅升高NHEKs细胞NF-κBp65磷酸化水平，而且促进磷酸化NF-κBp65入核；JASPAR数据库预测结果显示NF-κBp65与IL-15启动子区域存在结合位点，ChIP证实H2O2诱导NF-κBp65与IL-15启动子结合。然后，qRT-PCR、WesternBlot、ELISA和流式细胞术证实氧化应激下干涉NF-κBp65后，NHEKs细胞IL-15表达和反向呈递明显减少。因此，H2O2促进NHEKs细胞IL-15表达和反向呈递依赖NF-κBp65信号。最后，qRT-PCR和WesternBlot证实氧化应激下干涉NF-κBp65后，NHEKs细胞IL-15Rα表达也显著下降。因此，H2O2激活NHEKs细胞NF-κBp65信号，上调IL-15和IL-15Rα表达，从而促进IL-15反向呈递。 6.氧化应激NHEKs活化CD8+TEMs细胞。首先，CCK8结果显示250μM的H2O2溶液对角质形成细胞活力无明显影响。前述的流式结果已明确该浓度H2O2可明显促进角质形成细胞IL-15反向呈递。然后，流式证实CD3/CD28抗体或者氧化应激NHEKs细胞共培养均可上调CD8+TEMs细胞CD69表达。氧化应激NHEKs细胞共培养中加入MHC-I中和抗体，不能抑制CD8+TEMs细胞CD69表达上调，提示氧化应激NHEKs细胞通过非经典途径活化CD8+TEMs细胞。氧化应激NHEKs细胞上清轻度上调CD8+TEMs细胞CD69表达，而Transwell小室共培养明显抑制CD8+TEMs细胞CD69表达上调，提示氧化应激NHEKs细胞活化CD8+TEMs细胞依赖细胞间接触。流式结果证实氧化应激NHEKs细胞共培养中加入IL-15或CD122中和抗体，明显抑制CD69、IFN-γ、GzmB和PRF表达上调，提示氧化应激NHEKs活化CD8+TEMs细胞依赖IL-15/CD122信号。 7.反向呈递的IL-15通过JAK-STAT信号活化CD8+TEM细胞。流式结果证实角质细胞反向呈递的IL-15促进CD8+TEM细胞STAT3和STAT5磷酸化；托法替尼预处理CD8+TEM后，反向呈递的IL-15促进STAT3和STAT5磷酸化可被显著抑制，CD69、IFN-γ、GzmB及PRF表达升高也被明显抑制，提示反向呈递的IL-15活化CD8+TEM细胞依赖JAK-STAT信号通路。 结论： 氧化应激诱导角质形成细胞NFκBp65信号活化，促进IL-15和IL-15Rα表达，从而诱导角质形成细胞IL-15反向传递。反向呈递的IL-15通过CD122-JAK-STAT信号轴活化CD8+TEMs细胞，从而参与启动白癜风的异常免疫应答。因此，靶向IL-15-JAK-STAT信号轴，有望成为白癜风的有效治疗策略。
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