摘要
磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate3-kinase，PI3K）作为细胞内重要的信号传递因子，能够整合细胞外生长因子、细胞因子和其他刺激，传递给下游信号通路从而调控细胞代谢、生长和增殖等多个生理学功能。在多种肿瘤中均发现PI3K的异常激活。其中，编码Ⅰ类PI3K催化亚基p110α的PIK3CA基因在乳腺癌中的突变率高达约40％。PI3KCA基因突变主要集中在3热门位点:E542K、E545K、H1047R，这3热点突变能使PI3K不依赖于上游刺激而持续性激活下游AKT/mTOR信号通路。研究表明PIK3CA突变能诱导人乳腺上皮细胞的致癌转化，能在多种小鼠模型中促进乳腺癌的发生发展，但其机制尚不明确。为探明PI3K活化突变促癌转化机制，本实验室以正常人乳腺上皮细胞MCF-10A为工具，构建了高表达PIK3CAH1047R的细胞株MCF-10A/H。前期研究发现在无血清培养条件下MCF-10A/H细胞呈现出一系列衰老相关表征，如细胞体积变大、形态变扁平、SA-β-gal染色呈阳性等。在本研究中，进一步确证PI3K信号通路活化在细胞衰老中的作用，探索PI3K活化诱导细胞衰老的机制以及衰老细胞对乳腺癌发生发展的影响。 无血清条件下培养96小时后，MCF-10A/H细胞内SA-β-gal活性显著升高，而亲本细胞中该活性并无明显变化，证实血清饥饿诱导MCF-10A/H细胞衰老。MCF-10A/H细胞中SA-β-gal阳性比例随着血清饥饿时间的延长而升高，当细胞血清饥饿培养时间延长至96小时后，高达约80％的细胞发生衰老。与此同时，观察到MCF-10/H细胞在正常培养条件下和亲本细胞增殖速度相当，而在血清饥饿压力下增殖速度远高于亲本细胞。衰老细胞的一大主要特征是不可逆转的增殖抑制。在血清饥饿压力下MCF-10A/H细胞增殖似乎与衰老发生相矛盾。用EdU标记增殖细胞的同时用SA-β-gal染色指征衰老细胞，发现MCF-10A/H细胞血清饥饿处理96小时后，EdU阳性的细胞SA-β-gal染色呈阴性，SA-β-gal染色阳性的细胞中并未检测到EdU掺入，表明MCF-10A/H细胞在血清饥饿压力下一部分细胞发生衰老，而另一部分细胞仍然保持一定的增殖能力。同时，发现数株含PIK3CA激活性突变的乳腺癌细胞如T47D、JIMT1、HCC1954、BT20、EFM192A和MCF7细胞在无血清条件下培养96小时后，衰老细胞比例有不同程度的增加，表明PI3K活化也能诱导乳腺癌细胞发生衰老。敲低MCF-10A/H细胞内p110α蛋白能抑制血清饥饿的细胞发生衰老，而抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路活性同样能阻滞细胞衰老的发生，表明MCF-10A/H细胞衰老的发生依赖于PI3K信号通路。 RB和p53被认为是介导细胞衰老发生的重要因子，细胞发生衰老往往伴随着这两个蛋白的累积。然而，并未发现在衰老的MCF-10A/H细胞中发生RB或p53蛋白累积，p53下游分子p21蛋白水平在血清饥饿24小时后发生轻微上调但随着饥饿时间进一步延长而降低。采用nutlin-3a处理MCF-10A/H细胞上调胞内p53水平并能促进衰老的发生，而特异性si-RNA片段下调p53表达对衰老并无明显影响，提示MCF-10A/H细胞衰老的发生并不依赖于p53。 基因表达谱聚类分析发现细胞膜金属-肽链内切酶(Membrane metallo-endopeptidase，MME)在MCF-10A/H细胞中表达量高于亲本细胞，且在血清饥饿处理下进一步升高。下调MME表达能显著抑制血清饥饿的MCF-10A/H细胞发生衰老，而过表达MME则能促进衰老的发生。MCF-10A/H细胞中MME表达变化并不影响AKT磷酸化水平，而抑制PI3K/mTOR信号通路活性则下调MME表达，表明MME位于PI3K通路下游且介导衰老的发生。发现血清饥饿处理后的MCF-10A/H细胞中MME蛋白条带在SDS-PAGE中发生明显地上移，提示MME可能发生翻译后修饰。糖苷酶PNGase F处理能抑制MME蛋白上移，而糖基转移酶抑制剂tunicamycin能抑制MME条带上移的同时阻碍MCF-10A/H细胞衰老的发生，表明糖基化的MME介导了PI3K活化诱导的衰老。 细胞发生衰老后能通过分泌一系列因子如细胞因子、趋化因子和生长因子等，与其微环境发生相互作用。来自衰老的MCF-10A/H细胞相比于来自血清饥饿的MCF-10A细胞的条件培养基能显著促进MCF-10A细胞增殖，下调MCF-10A/H细胞中p110α或MME表达量则能取消这种促细胞增殖效应，表明细胞发生衰老的同时伴随着促增殖因子的分泌。悬浮芯片结果发现衰老的MCF-10A/H细胞相比于血清饥饿的亲本细胞，其IL-6、CXCL1、CXCL8、CCL13和CCL2分泌显著增加。乳腺癌细胞发生衰老的同时也伴随着IL-6分泌增多。IL-6能促进MCF-10A细胞增殖，当IL-6被中和后其促增殖效果被抑制。衰老MCF-10A/H细胞来源的条件培养基中IL-6被特异性抗体中和后，其促增殖效果被减弱;而向亲本细胞来源的条件培养基中添加IL-6则可促进MCF-10A细胞增殖，表明衰老细胞相关IL-6的分泌能促进细胞增殖。下调血清饥饿的MCF-10A/H细胞中的PI3K或MME表达均能抑制IL-6的分泌，表明衰老的MCF-10A/H细胞相关IL-6分泌依赖于PI3K和MME。 肿瘤的发生发展离不开肿瘤微环境中的各类免疫细胞的参与。检索TIMER数据库()发现含PIK3CA突变的乳腺组织比PIK3CA野生型的组织中巨噬细胞浸润比例更高，且巨噬细胞浸润程度与组织中MME表达量正相关。衰老的MCF-10A/H细胞能诱导人THP-1细胞来源和小鼠骨髓细胞来源的M0型巨噬细胞极化成M2型，下调血清饥饿的MCF-10A/H细胞中CCL2的表达能抑制极化作用，表明衰老细胞能通过分泌CCL2促进巨噬细胞向M2型极化。下调CCL2表达量对细胞衰老发生、p110α或MME表达量并无显著影响，而下调MCF-10A/H细胞内p110α或MME表达量能降低CCL2分泌量，表明衰老细胞相关CCL2的分泌依赖于P13K和MME。 综上，PIK3CA基因活化突变能诱导血清饥饿的人乳腺上皮细胞和人乳腺癌细胞发生衰老。衰老细胞能在缺少促增殖因子的条件下创造一个促癌微环境，且这一过程依赖于PI3K信号通路和MME调控的衰老相关促癌因子的分泌。本研究部分阐明了PI3K活化的促癌机制，为乳腺癌的预防和治疗提供了新思路，但MME调控细胞衰老机制仍需进一步研究。
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