摘要
植物病毒性病害每年给全球作物产量带来高达10％-15％的损失，尤其是单链DNA形态的双生病毒(Geminiviruses)能够给谷物、蔬菜和水果等作物造成严重损害。由于双生病毒具有传播迅速、感染面积大、使作物严重减产等特点，该病害已成为世界性的难题。目前，常规的抗双生病毒策略虽然已经取得了一定的成功，但这些策略也有相应的局限性。CRISPR/Cas系统是在细菌和古菌中发现的一种适应性免疫系统，能够特异清除入侵的外源DNA片段，包括噬菌体和质粒。其中CRISPR/Cas9系统已被改造成一种特异、高效及通用的基因组编辑技术。目前该技术已被广泛应用于植物功能基因的解析和优异性状的改良，因而对分子育种起到重要作用。本研究以甜菜严重曲顶病毒(Beet severe curly top virus，BSCTV)为目标，利用CRISPR/Cas9系统在模式植物烟草和拟南芥中构建了新型、高效的双生病毒防御体系，显著提高植物抵御双生病毒病害的能力。通过生物信息学分析结合二代测序技术进一步发现组成型表达的CRISPR/Cas9系统在转基因拟南芥中会导致脱靶效应。进而通过构建病毒诱导型的CRISPR/Cas9系统(virus-inducible genome-editing system，VIGES)，实现了高效抵御BSCTV的同时避免脱靶效应的产生。研究结果包括: 第一、利用组成型表达的CRISPR/Cas9系统在烟草和拟南芥中建立高效抵御BSCTV的抗病毒体系。首先在烟草中建立起农杆菌介导的瞬时筛选系统，利用该系统能够快速筛选出切割病毒靶位点sgRNA的活性。通过对在BSCTV基因组上不同区域共设计的43个靶位点sgRNAs进行筛选，结果表明基于CRISPR/Cas9系统的抗病毒策略是序列依赖性，与病毒基因组的功能无关。进一步分析证明CRISPR/Cas9系统是能够直接靶向切割胞间活性移动的病毒基因组DNA，且所造成的突变多为碱基的删除。而通过农杆菌的侵染将筛选出的高活性靶位点载体pHSN401-A7与pHSN401-C3分别引入到烟草和拟南芥中，T1代的转基因烟草(A7-1和A7-2株系)和T2代的转基因拟南芥(C3-1和C3-2株系)都能对BSCTV产生较强的抗性，且抗性的强弱与Cas9表达量的强弱相关。 第二、利用高通量的二代测序分析发现基于组成型CRISPR/Cas9系统的抗双生病毒策略具有脱靶效应的缺点。以具有高抗性的T2代pHSN401-C3转基因拟南芥(C3-2)为目标，生物信息学分析表明C3靶位点sgRNA在拟南芥基因组上的潜在脱靶位点至少有3个碱基错配。选择10个以NGG或NAG为PAM的潜在脱靶位点通过二代测序分析其突变情况，结果表明10个位点中有8个发生脱靶修饰，且最高的8号位点突变效率平均达0.74％。 第三、构建双生病毒诱导型的VIGES。利用GUS报告系统验证了pV86和pC86启动子能够有效响应BSCTV的诱导。另外，烟草的瞬时表达系统表明基于pV86和pC86启动子的两种VIGES载体能够同步响应病毒的积累并表达。利用烟草的瞬时筛选系统验证了VIGES载体(pV86-401和pC86-401)能够有效靶向切割BSCTV并抑制病毒DNA的积累。通过对T2代的pV86-C3和pC86-C3转基因拟南芥的抗病毒能力进行分析，结果表明pC86-C3系统载体能够高效抵御BSCTV，与组成型表达的CRISPR/Cas9系统效果相当。且VIGES载体抗性的强弱与启动子表达能力强弱有关。同时利用二代测序对转基因拟南芥不同组织的脱靶情况进行分析，并没有在10个潜在位点发现脱靶修饰。 本研究实践了CRISPR/Cas9系统在植物抵御双生病毒中的应用，并建立了新型、高效及特异的抗双生病毒策略。该策略为培育抗双生病毒的作物提供了重要的指导意义。
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