摘要
蚜虫是农业生产上的主要害虫，其种类繁多，几乎危害所有的栽培作物。高粱蚜(Melanaphis sacchari)是危害高粱(Sorghum bicolor(L.)Moench)的主要害虫之一，克隆高粱蚜抗性基因并对其抗蚜机制进行研究具有重要意义。本课题组前述研究发现高粱品种河农16(Henong16，HN16)中含有控制高粱蚜抗性的染色体位点RMES1(Resistance to M.sacchari1)，在此区域内发现两个串联排列的候选基因RMES1A和RMES1B。本研究的主要目的是:1）验证RMES1A和RMES1B都是高粱蚜抗性所必需的;2）对RMES1介导的高粱蚜抗性的生理和分子机制进行研究。 本研究以抗高粱蚜的HN16为背景进行甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulphonate，EMS)和快中子(Fast neutron，FN)处理，构建了2个诱变群体，各包含6793和7800份M1家系。通过田间以及温室苗期鉴定，筛选到4个感蚜突变体(aphid susceptible mutan，asm)，命名为asm1、sm2、asm3和asm4。asm1、asm2在RMES1A的编码区分别缺失了177bp和142bp，asm3、asm4都缺失了整个RMES1B。将asm1和asm4进行杂交并制备F2群体，通过分子标记鉴定在17385个F2中筛选到两个在RMES1B处发生了交换的单株，并从其F3自交群体中鉴定出了RMES1A和RMES1B的纯合双突变体。两个双突变体对高粱蚜均表现感性，因此证明RMES1A和RMES1B在高粱抗蚜中共同发挥作用，缺一不可。 对166份来自不同国家和地区的高粱材料进行接蚜鉴定，同时对其RMES1位点进行分子分析，发现五种表型-基因型互作。Ⅰ型抗蚜材料36份，均含有完整的RMES1A和RMES1B。Ⅱ型感蚜材料115份，既不含RMES1A，也不含RMES1B。Ⅲ型感蚜材料9份，含有突变的rmes1a和完整的RMES1B。Ⅳ型感蚜材料5份，含有突变的rmes1a而且缺少RMES1B。Ⅴ型感蚜材料1份，不含有RMES1A，但含有完整的RMES1B。对感蚜的Ⅲ型和Ⅳ型材料进行分析，发现突变的rmes1a均是在靠近其N端的同一位置发生了序列突变，而其它序列未发生变化，表明其N端在高粱抗蚜功能中起重要作用。 在非选择实验中，HN16上的蚜虫生长发育及繁殖受到严重阻碍，而在RMES1A和RMES1B的单突变体和双突变体上蚜虫均能正常生长发育和繁殖。在选择实验中，相比HN16，蚜虫更倾向于在单突变体和双突变体上进行取食和繁殖。这些结果表明RMES1A和RMES1B赋予HN16对高粱蚜的抗性机制兼具抗生性和排趋性。 在HN16中RMES1A和RMES1B的表达量均受高粱蚜取食诱导上调，在72h表达量均达到最大，在96h表达量都明显下降。亚细胞定位分析发现RMES1A和RMES1B蛋白均位于烟草的细胞膜上。推测RMES1A和RMES1B有可能在细胞膜区域识别蚜虫分泌的唾液或其引发的变化，从而启动抗蚜防御反应。 通过酵母双杂交实验发现RMES1A和RMES1B的N端肽段分别能够与自身互作，形成同源二聚体;同时相互之间也能互作，形成异源二聚体。而RMES1A和RMES1B的C端肽段或者全长均不能与自身互作或相互之间互作，且RMES1A和RMES1B的N端肽段和C端肽段之间也不能互作。荧光素酶互补实验(Luciferase complementation imaging assay,LCI)以及蛋白免疫共沉淀(Co-immunoprecipitaion，Co-IP)实验均证实RMES1A和RMES1B的N端能够形成同源二聚体和异源二聚体，因此推测RMES1A和RMES1B有可能通过其N端互作形成的二聚体在抗蚜过程中发挥作用。
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