摘要
癌症是现在医学界的一个重大难题，针对癌症的治疗，目前主流的治疗方法包括手术治疗、放疗、化疗等方式，其中化疗是最常用的治疗方式之一。依托泊苷(Etoposide，ETO)是一种广泛应用的拓扑异构酶抑制剂类化疗药物，生物利用率较低及肿瘤细胞产生化疗耐药性是其应用中面临的最大问题。开发ETO新剂型有助于提高其生物利用度，目前已报道的ETO新剂型包括混悬剂、脂质体、微乳、亚微乳、纳米乳、固体分散体、植入剂、微囊、微球等。联合化疗是指在一个化疗疗程中同时或者先后使用数种化疗药的一种用药方式，其通过利用作用机制不同的化疗药物提高药物对肿瘤细胞的杀伤率，进而提升抗肿瘤疗效;此外，联合化疗可以去除耐药因素，减少癌细胞产生耐药的可能性。由于联合化疗的优越性，目前单一用药方案已经被淘汰而成为历史。 亚微乳(Submicron emulsion，SE)是一类在表面活性剂和助表面活性剂的作用下，将油水两相进行融合，粒径在200nm以下的稳定分散体系，是一种新型的载药系统，可以有效的提高药物的生物利用度。近年来已有地西泮、两性霉素B、卡马西平等药物的亚微乳制剂上市，使载药亚微乳的研究无论在理论上还是实践上都取得了重要进展。吐温80是一种常用表面活性剂类药用辅料，在亚微乳的制备过程中发挥着增溶，乳化等重要作用。但吐温80的广泛使用被报道可能引发过敏性及溶血性等不良反应，从而引发严重的药品安全问题。 槐糖脂(Sophorolipids，SLs)是一类目前报道的最具潜力的生物表面活性剂，主要分为酸型槐糖脂(Acidic sophorolipid，ASL)与内酯型槐糖脂(Lactonic sophorolipid，LSL)两类，其中ASL具有更好的发泡与乳化能力，LSL具有更好的抗肿瘤等生理活性。综上，本研究首先探索和考察了ASL作为表面活性剂替代吐温80在制备新型ETO亚微乳中的理论和实践意义;随后考察了LSL与ETO的联合给药的抗肿瘤效果及安全性。通过开展上述研究，探索槐糖脂分别作为表面活性剂类药用辅料及抗肿瘤活性物质方面的潜力，扩大槐糖脂的应用范围。 本文主要的研究内容及研究结果如下: 1.ETO亚微乳制备工艺的优化及确定。优化亚微乳制剂的处方及制备工艺，以酸型槐糖脂取代吐温80制备依托泊苷亚微乳，得到最优工艺如下:MCT∶LCT=1∶1为油相，1.8％卵磷脂，搅拌至溶解，然后与水相混合，800bar，均质8次，酸型槐糖脂的添加量为0.8g/L。建立了依托泊苷亚微乳中依托泊苷的含量检测方法，避免药用辅料对出峰时间及出峰形状的影响，同时优化亚微乳制剂的表征方法，最终确定了2.5％的甘油溶液稀释20倍作为表征条件，成功制备并表征了两种亚微乳∶酸型槐糖脂-依托泊苷亚微乳(ASL-ESE)和吐温80-依托泊苷亚微乳(Tween-ESE)。 2.ASL-ESE及Tween-ESE理化性质的比较。以酸型槐糖脂和吐温80为表面活性剂制备所得的两种依托泊苷亚微乳为研究对象，检测和比较了两种亚微乳的粒径、Zeta电位、多分散系数(PDI)以及pH，载药量，包封率等指标。实验结果显示:ASL-ESE粒径为197.73nm，PDI为0.051，Zeta电位为-41.40mV，包封率为95.95％;Tween-ESE的粒径为195.8nm，PDI为0.167，Zeta电位为-43.47mV，包封率为93.01％,表明ASL-ESE在粒径分布和载药量方面均明显优于Tween-ESE，其中载药量提高了112.6％。利用透射电镜观察亚微乳的形态并考察了其体外释放特性。体外释放实验结果表明两种ETO亚微乳的体外释放特性均优于传统ETO注射液，且ASL-ESE的体外释放特性优于Tween-ESE。 3.ASL-ESE及Tween-ESE体外抗肿瘤活性的比较。两种亚微乳制剂的体外抗肿瘤试验结果表明:亚微乳制剂中的辅料对于细胞的毒性较小;亚微乳剂型相对于传统ETO注射液，具有明显的细胞增殖抑制作用。40μg/mL的ASL-ESE对卵巢癌A2780细胞的抑制率为78％，而同等浓度下，Tween-ESE的抑制率仅为36.64％。ASL-ESE的IC50仅为12.77μg/mL，远低于ETO注射液的158.35μg/mL，也低于Tween-ESE的84.8μg/mL。使用流式细胞仪检测了不同亚微乳对卵巢癌A2780细胞凋亡的影响。结果表明亚微乳制剂通过诱导细胞凋亡达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。其中，对照组的卵巢癌A2780活细胞比例为94.04％，凋亡率为5.87％。与对照组相比，ETO注射液处理组的卵巢癌A2780活细胞为59.33％，凋亡率为37.8％;Tween-ESE组的卵巢癌A2780活细胞为46.47％，凋亡率为52.1％;而ASL-ESE组的卵巢癌A2780活细胞仅为1.29％，凋亡率达到95.58％。此外，对所得ETO亚微乳进行了安全性评价，结果表明亚微乳制剂的安全性良好，无血管刺激性和过敏现象出现，也未产生溶血现象。 4.LSL与ETO联合用药的体外抗肿瘤活性及机制研究。首先考察了LSL对乳腺癌MCF-7，鼠源乳腺癌4T1，卵巢癌A2780，鼻咽癌CEN-28，黑色素瘤B-16，胃癌SGC-7901的体外抗肿瘤活性。结果显示:LSL对卵巢癌A2870的抑制效果最好，IC50仅为30.34μg/mL;对乳腺癌4T1细胞的抑制增殖作用也较好，IC50为36.17μg/mL。因此后续研究主要以卵巢癌细胞A2780及乳腺癌细胞4T1为研究对象。MTT法测定联合给药抗肿瘤效果的试验结果表明:对于卵巢癌A2780细胞，LSL的加入可以大幅降低药物的IC50。当LSL∶ETO为1∶1时，IC50仅为95.36μg/mL，相比于ETO单独给药，IC50降低了30.21％。对于乳腺癌4T1，LSL∶ETO分别为0∶4，1∶3，2∶2，3∶1，4∶0时，对应的IC50为93.36μg/mL，74.49μg/mL，53.65μg/mL，38.56μg/mL，36.17μg/mL。综合考虑后，选择LSL∶ETO为1∶1为后续试验中的最佳给药比例。 利用DAPI染色观察两种癌细胞株给药后细胞核的形态变化，发现两种癌细胞的细胞核染色质有明显的皱缩，甚至出现细胞核破碎现象。流式细胞术证实了针对于本研究所选的两种癌细胞株，联合给药都具有一定的协同作用。其中对卵巢癌A2780，依托泊苷单独使用时，细胞凋亡率仅为8.06％;LSL40μg/mL的给药浓度单独给药时，细胞凋亡率为到15.01％;而联合给药时凋亡率达到了23.95％。对乳腺癌4T1，依托泊苷单独使用时，细胞存活率达到83.5％;LSL40μg/mL的给药浓度单独给药时，细胞存活率为84.0％;而联合给药时细胞存活率降低至80.8％。联合给药组相对于单独给药可以提高依托泊苷的药效，并且是通过诱导凋亡的方式来抑制癌细胞。 5.LSL与ETO联合用药的体内抗肿瘤活性研究。将鼠源乳腺癌细胞4T1细胞按每只小鼠右侧腋下皮下注射1*106-1*107个活细胞，注射量0.1mL。接种后，每天观察小鼠生理状态及腋下成瘤情况。取荷瘤小鼠36只，分为模型组，依托泊苷组，内酯型槐糖脂组，低剂量联合给药组，中剂量联合给药组，高剂量联合给药组6组。每组6只。在观察成瘤后进行分组给药，采用灌胃给药的方式，给药量为0.2mL，连续给药7天。结果显示:无论是小鼠的平均体重还是小鼠的体重增长率，依托泊苷组均为最低，而内酯型槐糖脂给药组与联合给药组的小鼠的体重无明显变化。与模型组相比，依托泊苷组的抑制率最低为19.45％(p＜0.001)。联合给药组的肿瘤抑制率均高于单独给药组，高剂量联合给药组抑制效果最好，抑瘤率达到75.38％(p＜0.001)。
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