摘要
近年来，天然食源性ACE（血管紧张素转换酶）抑制肽由于活性高，吸收好等优点，在食品和医药领域具有潜在的应用前景，越来越受到研究者的关注。本论文以银杏种仁为原料，提取得到银杏蛋白，采用碱性蛋白酶Alcalase酶解得到水解产物，并通过响应面方法优化了制备工艺，再经过纯化鉴定得到银杏种仁ACE抑制活性肽，进一步研究了ACE活性肽对人脐静脉内皮细胞的影响，为银杏种仁ACE抑制肽的研究开发提供了一定的理论依据。主要研究结果如下: 1、银杏种仁ACE抑制肽制备的工艺优化。以水解度(DH)和多肽含量为指标，通过单因素试验和响应面优化试验得到了制备银杏ACE抑制肽的最佳酶解工艺，其最佳条件为:酶添加量2400U、超声波功率118W，超声时间23min，超声温度48℃。在此工艺条件下，多肽得率最高，为14.71％。 2、三种银杏种仁ACE抑制肽纯化与鉴定。采用超滤技术将银杏蛋白水解物进行粗分离，分为＜1kDa、1-3kDa、3-5kDa、5-10kDa以及银杏蛋白总水解物GPHs五个组分，研究了分子量与体外抗氧化活性及ACE抑制活性的关系。此外，使用葡聚糖凝胶层析进一步纯化后，进行LC-MS/MS鉴定，得到了3种可能的ACE抑制肽(TNLDWY、RADFY、RVFDGAV)，研究了这三种ACE抑制肽的竞争模式与相互作用。结果表明，分子量小的银杏肽其体外ACE抑制活性较高，鉴定得到的肽RVFDGAV体外ACE抑制活性最强，其IC50值为1.286mM，表现为竞争性抑制模式，而TNLDWY，RADFY表现为非竞争型抑制模式。分子模拟对接表明，三种ACE抑制肽与ACE结合良好并存在相互作用。由此，Alcalase制备得到的银杏肽具有有效的ACE抑制活性。 3、银杏种仁ACE抑制肽的作用机理。以人脐静脉内皮细胞(EA.Hy926)为模型，研究银杏种仁ACE抑制肽可能的降压机制。通过观察细胞活力与形态，分析细胞内的NO释放量、ET-1分泌量以及ROS水平，并从血压相关基因表达的层次研究抑制肽对细胞的影响。结果表明银杏种仁ACE抑制肽可能通过增加NO释放量，降低ET-1和ROS水平的分泌来达到降压的目的。荧光定量PCR结果显示细胞经ACE抑制肽处理后，RAAS系统中，ACE基因的mRNA水平明显下降，MAPK1、MAPK3、MAPK14基因的mRNA水平明显上升，血管功能中NOSTRIN、NF-κB基因的mRNA水平明显下降，ECE1、eNOS、JAM1、GUCY1A1、GUCY1B1基因的mRNA水平明显上升。
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