摘要
多数补气类中药在增强动物免疫力和恢复受免疫抑制动物的免疫力方面具有独特功效。本研究选用具有免疫增强作用的黄芪和白术两味补气类药材，经过水提醇沉、制粒、干燥等工序制备成复方芪术颗粒(Compound Huangqi&Baizhu granules，CHBG)，并进行了药物制剂学、毒理学以及药效学方面的研究，以期获得一种新的兽用免疫增强剂。现将研究结果分述如下: 1.CHBG黄芪白术配比筛选 为了获取疗效更优的CHBG，本文以雏鸡为试验动物，以黄芪与白术1∶3～3∶1不同比例配伍制备的颗粒为试验药物，同时设立疫苗免疫对照组，通过考察试验药物对新城疫(ND)疫苗抗体水平影响而筛选黄芪与白术的配伍比例。结果显示，当黄芪与白术比例为1∶1时，雏鸡ND抗体水平较疫苗免疫对照组显著升高（P＜0.05），且其抗体水平在所有药物试验组中最高。结果表明，黄芪与白术比例为1∶1时的颗粒剂具有较好的免疫增强作用，因此以此为基础制备CHBG。 2.CHBG的制备及稳定性研究 为了制备质量稳定、可控的GHBG，本文采用薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)法确定黄芪、白术的药材质量;在此基础上采用Ca(OH)2的碱水提醇沉的方法获取黄芪白术提取物，然后加入辅料、采用湿法制粒、干燥的工艺制得CHBG，再通过加速试验和长期稳定性试验考察稳定性。结果显示:(1)在黄芪和白术各自TLC图谱中，样品药材和对照品药材在相同位置显示相同荧光斑点;且两味药材的HPLC特征图谱与对照品药材的相似度均达到0.90以上，说明选用药材合格;(2)制得黄芪、白术的混合粗多糖，试验三批次的多糖平均得率为7.58％，其多糖含量为73.83％。制得的CHBG成品，每1g相当于原生药2g;(3)CHBG以市售铝塑包装密封后，在温度40±2℃，相对湿度为75±5％的环境中加速试验6个月以及在温度25±2℃、相对湿度60±10％的环境中放置18个月后，其外观性状、鉴别、含量等质量指标均符合CHBG质量标准要求。以上实验结果表明:选用合格的药材，采用Ca(OH)2的碱水提醇沉、喷雾干燥、湿法制粒获得的CHBG质量稳定，有效期可达18个月。 3.CHBG质量标准研究 为使CHBG质量可控，借鉴药典方法和采用TLC、HPLC等方法，建立CHBG的质量标准。结果:参考中国兽药典建立了CHBG的含量检测方法以及确定了CHBG的外观性状、水分、粒度、溶化性、微生物限度等检查项目;采用TLC法建立了CHBG定性鉴别多糖、黄芪甲苷、白术的方法;参考中国兽药典建立了HLPC检查CHBG中单糖、双糖含量的方法，并规定了检出限度;同时，采用HLPC法对9批CHBG特征图谱进行了考察，建立了CHBG的指纹图谱。结果表明，本试验建立的质量标准可用于CHBG的质量控制。 4.CHBG安全性评价 采用改良寇氏法和最大耐受药量试验法评价CHBG安全性，为临床安全用药提供依据。改良寇氏法未能测定出CHBG对小鼠口服的LD50，但最大耐受药量试验法测得CHBG对小鼠口服的最大耐受剂量为180g/(kg·bw)。在最大耐受药量时，小鼠体质量和脏器指数无明显变化。实验结果表明:CHBG对实验小鼠是安全的。 5.CHBG对小鼠非特异性免疫调节作用研究 为探讨CHBG对免疫缺陷动物的免疫调节作用，本文以小鼠为试验对象，采用环磷酰胺(cyclophosphamide，Cy)制作免疫抑制模型，再分别设立空白组、Cy组、Cy+CHBG3.75组(注:给药剂量为3.75g/(kg·bw)，本节下同）、Cy+CHBG75组、Cy+CHBG15.0组，并分别考察CHBG对小鼠免疫器官指数、碳粒廓清功能、脾淋巴细胞增殖、血清溶菌酶及TNF-α、IL-2、IL-4、IFN-γ等细胞因子的影响。同时设立空白组、黄芪多糖组、CHBG3.75组、CHBG7.5组、CHBG15.0组，采用流式细胞术测定CHBG对正常小鼠脾淋巴细胞亚群的影响。实验结果显示:(1)Cy处理可引起脾脏指数、胸腺指数下降，并能抑制脾淋巴细胞增殖，导致血清溶菌酶含量以及TNF-α、IL-2、IL-4、IFN-γ等细胞因子水平下降。其中脾脏指数、血清溶菌酶含量以及IFN-γ等细胞因子水平比空白组显著下降(P＜0.05)，说明Cy处理引起了明显的免疫抑制。(2)与Cy组比较，CHBG15.0可显著提高脾脏指数、IFN-γ的含量(P＜0.05)，极显著提高血清溶菌酶的含量(P＜0.01);CHBG7.5可极显著提高脾脏指数、胸腺指数、血清溶菌酶的含量(P＜0.01);CHBG3.75可显著恢复并促进小鼠脾淋巴细胞增殖、显著提高IL-4的含量(P＜0.05)，极显著提高脾脏指数、血清溶菌酶的含量(P＜0.01)。CHBG各剂量组均可提高碳粒廓清指数和吞噬指数，但差异不显著（P＞0.05）;对TNF-α、IL-2的生成也无明显影响。(3)CHBG3.75可显著降低正常小鼠CD8+T细胞的数量（P＜0.05），并显著提高CD4+/CD8+比值（P＜0.05），且除CHBG15.0组的CD4+T细胞的数量和CD4+/CD8+的比值显著低于黄芪多糖组(P＜0.05)，CD8+T细胞的数量显著高于黄芪多糖组(P＜0.05)外，CHBG3.75组和CHBG7.5组的CD4+、CD8+T细胞的数量以及CD4+/CD8+的比值均与黄芪多糖组的差异不显著（P＞0.05）。以上试验结果表明:CHBG可明显恢复Cy所致小鼠免疫器官发育的抑制作用，能增强Con A诱导的脾淋巴细胞增殖反应;增强单核巨噬细胞的吞噬功能、促进溶菌酶释放，诱导机体产生IFN-γ、提高血清中IL-4的含量，还可提高CD4+/CD8+T淋巴细胞比值。 6.CHBG对ND疫苗免疫效果的影响 为考察CHBG对ND疫苗免疫效果。以口服0.5、1.0、2.0、3.0、5.0g/L的剂量在每次免疫后连续给药7d，考察不同剂量CHBG对雏鸡ND抗体水平的影响;以整个免疫期连续给药、首免和二免后连续给药1周以及首免后给药1周的三种方案给药，考察CHBG的不同给药方案对雏鸡ND抗体水平的影响。结果显示:(1)当口服不同剂量CHBG时，与疫苗免疫对照组比较，在首免后的第1、2周，CHBG1.0（注:给药剂量为1.0g/L饮水给药，本节下同）组的抗体水平显著升高(P＜0.05)，在二免后第1、2周时，抗体水平极显著升高(P＜0.01)。与黄芪多糖组比较，CHBG各剂量组中除CHBG5.0组在35日龄时的ND抗体水平显著低于黄芪多糖组外(P＜0.05)，而其余各组与其差异均不显著（P＞0.05）。(2)采取不同给药方案时，与免疫对照组比较，在几种方案中，以每次免疫ND疫苗后，饮水给予1.0g/L剂量的CHBG，并连续给药7d的方案较好，其在首免后第1、2周，雏鸡ND抗体水平可显著增加（P＜0.05），在二免后第1、2周时，雏鸡ND抗体水平极显著增加(P＜0.01);且用药成本低。 综上所述，采用本试验方法制备的CHBG安全、稳定;同时建立了CHBG质量标准，其检测方法简单、可行，可用于CHBG的质量控制。动物试验证实CHBG既可以恢复和增强机体的非特异性免疫，也能增强机体的特异性免疫，同时提供了CHBG的临床使用方案，即每次免疫后以1.0g/L剂量饮水连续给药7d，有助于雏鸡ND抗体水平的提高，可为雏鸡提供更好的保护。
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