摘要
甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus，SCSMV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)禾草病毒属(Poacevirus)，是引起甘蔗花叶病的三种主要病原之一。SCSMV的P1蛋白能抑制单链RNA诱导的局部沉默，但尚不了解其能否抑制系统沉默和双链RNA引起的局部沉默，以及其是否具有致病决定因子的功能。植物病毒编码的抑制子蛋白的亚细胞定位，能够显著影响其RNA沉默抑制的活性，继而调控病毒的致病性。 本研究首先利用农杆菌浸润本氏烟的瞬时表达实验来确定P1蛋白的沉默抑制活性。将P1与ssGFP及含发夹结构的dsFP在本氏烟上混合注射，番茄丛矮病毒(Tomato bushystunt virus，TBSV)的抑制子P19作为阳性对照，空载体作为阴性对照。3天后在紫外灯下观察注射叶片，发现P1注射区域与P19一样有很强的绿色荧光，阴性对照基本无荧光，说明P1能抑制单链或双链RNA诱导的局部沉默。Western blot检测结果与观察结果一致，P19与P1区域的GFP蛋白量明显多于空载体。在16c转基因本氏烟上混合注射P1和ssGFP来确定P1的系统沉默抑制能力。14天后发现表达P1的烟草有17％发生沉默，这表明P1类似于P19，都能够抑制系统RNA沉默。 本研究通过PVX异源表达系统证明P1是一个致病决定因子。将P1蛋白构建到PVX异源表达载体得到PVX-P1。通过农杆菌浸润技术在本氏烟上接种PVX-P1和作为对照的PVX-GFP，发现P1能导致寄主花叶症状加剧，随重组病毒侵染时间延长，发现叶片出现大面积坏死，这证明P1是SCSMV编码的一个强致病决定因子。 本研究首次发现SCSMV P1蛋白在细胞质和细胞核均有分布，但不进入核仁。通过软件预测发现其具有两个核定位信号，将其核定位信号中的赖氨酸(Lysine，K)和精氨酸(Arginine，R)突变为丙氨酸(Alanine，A)得到nlsⅠm、nlsⅡm、nlsⅢm突变体。通过激光共聚焦显微镜，我们发现突变体nlsⅠm、nlsⅡm仍有部分P1蛋白能够入核(35％-40％)，nlsⅢm只有少量P1蛋白能定位到细胞核中（小于10％）。进而，我们通过在P1蛋白的N端分别加上入核信号和出核信号得到NLSm和NESm突变体。通过激光共聚焦显微镜观察发现，突变体NLSm完全入核，而NESm只存在于细胞质中。Western blot检测发现P1及各P1突变体确实发生表达。 为了明确核定位信号突变体抑制RNA沉默的活性，我们分别将上述五个突变体与ssGFP共注射，三天后发现五个突变体注射区域都基本没有荧光，说明GFP蛋白的mRNA被植物沉默，突变体抑制RNA沉默的活性显著降低。Western blot检测显示P1突变体与ssGFP共注射不表达，与P19共注射时表达。 通过PVX超表达P1突变体，9天后，植株表现花叶症状，相较于野生型P1，突变体的症状较轻，但是引起的花叶、卷曲症状强于PVX-GFP;其中nlsⅠm、nlsⅡm的症状强于nlsⅢm、NLSm和NESm。14天后，PVX-P1植株上部叶片出现坏死，nlsⅠ、nlsⅡ植株注射叶片也出现坏死，但相对于PVX-P1侵染植株，坏死程度较小。DAB染色和台盼蓝染色结果也证明P1能引起细胞氧爆发及坏死。Western blot和RT-PCR检测结果确定P1及P1突变体发生表达。 综上所述，P1能抑制单链RNA诱导的局部沉默和系统沉默以及双链RNA引起的局部沉默，且是一个强致病决定因子。P1定位于细胞质和细胞核，其定位的改变会显著降低P1抑制RNA沉默的活性，并削弱其致病性。
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