摘要
目的：下腰痛是影响人类健康、社会发展的疾病，而椎间盘退变正是的重要原因之一，但目前医学界尚缺乏针对于延缓椎间盘退变进程的药物。氧化应激是导致椎间盘退变的重要因素，可以导致髓核细胞的衰老与细胞外基质结构破坏。虎杖苷作为白藜芦醇衍生物，被报道可以通过激动Nrf2在多种疾病模型中发挥抗氧化作用，但是其在椎间盘退变中的治疗效果尚未发现。本实验目的是研究虎杖苷对椎间盘退变的治疗作用上，再从Nrf2信号通路来揭示其中的作用机制。 方法：利用无菌手术器械、二型胶原酶、胎牛血清以及培养基从SD大鼠尾巴提取原代大鼠椎间盘髓核细胞并培养，用TNF-α来诱导炎症相关的氧化应激环境，并用虎杖苷来治疗髓核细胞退变。用CCK-8试剂套装检测虎杖苷对髓核细胞活性以及增殖情况的影响。利用β-半乳糖苷酶衰老染色试剂盒和EdU试剂盒来检测髓核细胞衰老以及增殖情况，用Westernblot来检测虎杖苷对髓核细胞的衰老、细胞外基质合成分解能力以及Nrf2信号通路的影响。采用MitoSOX、MitoTracker、MDA试剂盒以及ATP检测试剂盒来评估虎杖苷对应激环境下髓核细胞内线粒体的保护作用。通过对照-siRNA和Nrf2-siRNA转染髓核细胞，来检测虎杖苷是否通过激动Nrf2来发挥治疗效果。在确定虎杖苷的体外治疗效果后，在体内用穿刺针建立SD大鼠椎间盘退变的模型。用虎杖苷预处理并在造模手术后继续给药，在术后第4周，利用磁共振检查大鼠椎间盘退变情况，并用阿利新蓝染色观察椎间盘细胞外基质情况，采用组织免疫荧光观察椎间盘内Nrf2的激活情况以及p53和p16表达情况。 结果：CCK8实验提示虎杖苷的最大安全浓度为400μM。β-半乳糖苷酶衰老染色实验显示虎杖苷处理后的细胞与TNF-α组相比较，衰老染色阳性的细胞减少,而且EdU染色显示，虎杖苷可以提高TNF-α刺激后的核内EdU的荧光强度，并且髓核细胞衰老相关蛋白p53和p16蛋白表达水平在虎杖苷处理后下降。在细胞外基质方面，虎杖苷处理过的髓核细胞，在TNF-α作用下，其基质合成相关蛋白Aggrecan和COLII表达上调，而基质降解酶ADAMTS-4、MMP-13和MMP-3的水平下降。在线粒体功能方面，MitoSOX染色显示TNF-α会加重细胞内氧化应激水平，而虎杖苷处理后，细胞内荧光强度明显下降。MDA检测结果显示，虎杖苷可以减少应激情况下髓核细胞内MDA的聚积；MitoTracker染色显示虎杖苷处后细胞的荧光强度显著提高。ATP检测实验显示在予以虎杖苷治疗后，髓核细胞内的ATP水平提高。在Nrf2信号通路方面，Westernblot显示虎杖苷不仅可以提高细胞核内Nrf2的水平，还可以减少全细胞内Keap1的表达并提高HO-1的水平。细胞免疫荧光结果也显示了虎杖苷可以提高髓核细胞核内Nrf2的水平。同时，我们也发现了Nrf2沉默后，髓核细胞内的p53、p16、MMP-13和MMP-3水平上升，Aggrecan的表达水平下降。另外，Nrf2沉默后的髓核细胞内的MitoSOX荧光强度增加，MitoTracker荧光强度下降。在体内实验，磁共振显示，虎杖苷治疗组大鼠椎间盘的信号强度要高于单纯退变组。阿利新蓝染色显示了，相比单纯退变组，虎杖苷治疗后椎间盘外基质含量增加。组织免疫荧光显示，虎杖苷治疗组的大鼠椎间盘具有更高的Nrf2表达和更低的p53和p16表达。 结论：虎杖苷可以改善TNF-α刺激下的髓核细胞衰老、细胞外基质破坏以及线粒体功能紊乱。虎杖苷还可以促进髓核细胞内Nrf2信号通路的激活。另外，通过siRNA沉默Nrf2，我们发现虎杖苷对延缓髓核细胞的衰老、细胞外基质保护作用以及对线粒体保护作用减弱，并且沉默后的髓核细胞内氧化应激的水平也出现了上升，提示了虎杖苷可以通过激活Nrf2对抗氧化应激以保护髓核细胞。体内实验提示，虎杖苷除了可以激动椎间盘内Nrf2的表达，还可以有效的延缓椎间盘的退变进程。因此，我们发现了新型小分子Nrf2激动剂虎杖苷可以用于治疗椎间盘退变，为丰富椎间盘退变的内科治疗提供了理论基础。
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