摘要
目的 在小鼠骨髓内皮祖细胞（EPCs）的基础上，分离淋巴管内皮祖细胞（LEPCs），并引入外源性血管内皮生长因子-C（VEGF-C）进行干预，完善小鼠淋巴内皮祖细胞（LEPCs）体外分离、培养及诱导分化的实验方法。 方法 1、研究以C57BL/6小鼠为对象，通过改良差时贴壁法收集48小时内未贴壁的细胞，并使用EGM-2MV培养基培养至第三代，从而分离纯化骨髓细胞中的内皮祖细胞（EPCs）。 2、使用流式细胞仪检测第三代细胞表面标记物CD34、CD133、VEGFR-3，并分析VEGFR-3+CD34+细胞和VEGFR-3+CD133+细胞在EPCs中所占的百分比。 3、通过流式细胞术分选出表面标记物血管内皮生长因子受体-3（VEGFR-3）阳性的细胞，并使用免疫荧光化学法鉴定其表面CD34、CD133的分布及表达情况。 4、将流式细胞仪分选出的LEPCs培养至第3代，用MTT比色法检测LEPCs增殖能力。 5、引入外源性血管内皮生长因子-C（VEGF-C）对LEPCs进行诱导分化，光镜下观察LEPCs形态变化，诱导分化28天后通过免疫荧光化学法检测淋巴管内皮透明质酸受体-1（LYVE-1）表达情况。 6、用50ng/ml、100ng/ml及150ng/ml三组不同浓度VEGF-C对LEPCs进行诱导分化，通过免疫荧光化学法检测LYVE-1在三组中的表达情况。 结果 1、流式细胞仪检测结果VEGFR-3+CD34+细胞占EPCs细胞的0.67%，VEGFR-3+CD133+细胞占EPCs细胞的1.52%。免疫荧光化学法检测显示流式细胞仪分选出VEGFR-3+细胞的细胞膜上同时表达CD34及CD133，即分选的细胞为LEPCs。 2、LEPCs体外增殖能力较强，前3天细胞数量无明显变化，第4天开始进入对数生长期，第11天后进入平台期，生长曲线呈现“S”形。 3、LEPCs经过VEGF-C诱导分化用免疫荧光化学法检测其表面表达淋巴管内皮特殊标记物LYVE-1。 4、浓度为100ng/ml的VEGF-C是体外诱导分化小鼠骨髓LEPCs的理想浓度 结论 通过差时贴壁法和流式细胞仪可从小鼠骨髓中分离提纯LEPCs，EGM-2MV培养基可扩增LEPCs，VEGF-C可诱导LEPCs向淋巴管内皮细胞分化。
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