摘要
兜兰属植物唇瓣呈兜状，是一种高档花卉。由于人类大量采挖和生存环境被破坏，野生兜兰成为了世界上最濒危的植物物种之一。组织培养兜兰杂交种可以得到性状均一的种苗，繁殖效率比常规的分株繁殖高，可以满足商业市场的需要，在获得经济利益的同时并减少人类对野生兜兰的采挖。本文通过研究培养环境（温度）、培养基成分和培养材料的处理方法（纵切）对兜兰组织培养的影响以及炼苗、移栽基质和组培苗大小对其移栽生长速度的影响，得到兜兰克隆繁殖效率最高的方案，并且研究得知组培苗在温室移栽需要的最适条件，为兜兰杂交种种苗的组培快繁和商业生产奠定技术基础，也为其它兜兰属植物的组织培养提供参考。研究结果如下: 1.温度对兜兰组织培养的影响:30.0℃是PLB和不定芽的混合体中PLB增殖的最佳温度，25.0℃、27.5℃是PLB和不定芽的混合体中不定芽增殖的最佳温度;27.5℃、30.0℃为不定芽伸长生长的最佳温度;25.0℃、27.5℃条件下不定芽生根率和生长指数最大，但是27.5℃条件下根长大于或等于1 cm的组培苗比25℃条件下的多。低温22.5℃条件下PLB和不定芽的混合体、不定芽生长速率非常缓慢;高温32.5℃条件下PLB和不定芽的混合体会逐渐死亡。30.0℃条件下瓶苗叶片的叶绿素含量、Fv/Fm比低于30.0℃条件下培养的均显著降低，未出现小苗死亡现象;温度为30.0℃时PLB和不定芽的混合体的可溶性糖含量显著升高，PLB和不定芽的混合体材料出现高温胁迫反应。27.5℃、30.0℃条件下不定芽起始培养的鲜重和生长指数呈显著负相关，R2分别为0.298和0.412。研究结果表明培养温度对兜兰组织培养影响较大，可根据不同的培养目的选择合适的培养温度。 2.培养基成分对混合体增殖和分化的影响:以1/8 MS为基本培养基添加5g·L-1蔗糖、5％椰子汁和3 g·L-1蛋白胨是最适合PLB增殖的培养基;PLB和不定芽的混合体在以1/2MS为基本培养添加20 g·L-1蔗糖、5％椰子汁和(0、1) g·L-1蛋白胨的培养基中不定芽增殖系数最高。生长调节剂的单因素实验表明BA和TDZ促进PLB分化，0.1 mg·L-12，4-D最适合PLB增殖，0.5 mg·L-12，4-D最适合PLB诱导出愈伤组织。而PLB在以1/2MS为基本培养基添加20 g·L-1蔗糖、5％椰子汁、3 g·L-1蛋白胨和0.1 mg·L-12，4-D的培养基中增殖效果较差;结果表明低浓度的大量元素和蔗糖的组合有利于PLB增殖，但是培养出的PLB和不定芽的混合体需要先在大量元素浓度较高的培养基（1/4MS为基本培养基添加5 g·L-1蔗糖、5％椰子汁和3 g·L-1蛋白胨）培养再在蔗糖浓度较高的培养基（1/2MS为基本培养添加20 g·L-1蔗糖、5％椰子汁和1 g·L-1蛋白胨的培养基）中培养才能高效完成PLB的分化过程;一般的大量元素和蔗糖的组合(1/2MS为基本培养基添加20 g·L-1蔗糖)有利于PLB分化为不定芽却不利于PLB增殖。 3.Paphiopedilum SCBG ZK68组织培养研究:采用相同的切割处理，大芽（6-8片叶）比小芽（3-4片叶）增殖系数高;对于相同类型的不定芽，纵切处理比未纵切处理增殖系数高。第一次培养纵切大芽在添加0.75 mg·L-1 TDZ的培养基中不定芽增殖系数最高;第二次培养纵切小芽在添加0.75 mg·L-1 TDZ的培养基中出现的叶丛芽最多。叶丛芽在1/2 MS添加20 g·L-1蔗糖、15％椰子汁和0.75 mg·L-1 TDZ的培养基中增殖系数最高。TDZ诱导并增殖出的叶丛芽平均每单位在1/2MS外加20 g·L-1蔗糖、5％椰子汁和3 g·L-1蛋白胨的培养基中经过3次培养后可以获得53.72个正常的不定芽。采用叶丛芽增殖途径的繁殖效率是一般的不定芽增殖途径的5倍以上，并且叶丛芽增殖倍率更稳定。叶丛芽的诱导、增殖及恢复成正常不定芽的方法可以为其它兜兰或兰科植物的组织培养提供参考。 4.兜兰组培苗移栽后生长速度的影响因素及评价方法:移栽前兜兰瓶苗的Fv/Fm和其叶宽没有相关性，但是经过炼苗的瓶苗移栽一个月后叶尖坏死率为19.44％而未经过炼苗的组培苗的为83.72％。每一种基质中，组培苗的叶宽和移栽154天后总的叶片增加长度成正相关，组培苗Ⅱ（叶宽大于1.39 cm）的总的叶片增加长度的平均值显著大于组培苗Ⅰ（叶宽小于或等于1.39 cm）的，组培苗叶宽是影响其移栽后总的叶片增加长度的主要因素。组培苗Ⅱ在基质Ⅰ(植金石∶泥炭土=1∶1，v/v)、Ⅱ(松树皮∶泥炭土=1∶1，v/v)中总的叶片增加长度最大，平均分别为5.62 cm和5.52 cm。在移栽35天以后，基质V中组培苗的Fv/Fm和移栽154天后总的叶片增加长度的相关性最强，但由于组培苗的Fv/Fm容易受到移栽基质和测定时间点的影响，用Fv/Fm预测任何基质中组培苗移栽后的生长状况并不是一个简单而有效的方法。该研究总结的评价兜兰组培苗移栽后生长状况的方法（以总的叶片增加长度表示生长速度），能为提高出瓶苗移栽成活和加快生长以及筛选出合适的移栽基质提供依据。
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