摘要
酵母菌(Yeast)体中含有的丰富蛋白质已成为单细胞蛋白质工业中重要资源，而食用酵母菌体自溶物也被广泛用作培养基组成中的营养物质，如酵母浸出物;另外，酵母菌还含丰富维生素，主要为水溶性B族维生素，它们多以辅酶组分形式存在于细胞中，因而酵母菌可作为人或动物的B族维生素来源。我国饲料级B族维生素每年市场需求量已经超过12万t，占全球总需求量的1/5以上。我国已成为维生素需求缺口大国，因此筛选出高产B族维生素酵母菌用于饲料行业具有重大意义。 本研究首先以酵母菌生物量及B族维生素（B1、B2、B6、烟酸）含量为指标，筛选出一株B族维生素含量及生物量均较高的酵母菌PJ-36。然后采用形态学观察、生理生化实验及26S rDNA分子学手段鉴定出其种属。其次对该菌株进行复合诱变，得到一株高产菌株UD-17。再次对该菌株发酵条件及培养基进行优化。最后对该菌株进行补料发酵实验。主要研究成果如下: (1)本研究从腐烂水果皮及果园土壤中筛选得到56株酵母菌，采用紫外分光光度法初筛及高效液相色谱法(HPLC)复筛。最终得到一株生物量达7.86g/L的高产菌株P J-36。采用HPLC法测得其维生素B1、B2、B6、烟酸含量分别为136.19、65.08、45.22、407.20（单位:μg/g），四种B族维生素总含量达653.69μg/g。此外，对HPLC进行验证试验，结果表明该法精密度及准确性良好。 (2)对几株高产菌株进行形态学观察及生理生化实验初次鉴定，之后将PJ-36菌株送往上海生工生物工程有限公司进行分子生物学鉴定，鉴定结果与初次鉴定结果相一致，最终将其鉴定为酵母属的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。 (3)以PJ-36为出发菌株，在确定最佳紫外及硫酸二乙酯诱变条件后进行两轮紫外-硫酸二乙酯(UV-DES)复合诱变，最终得到一株高产B族维生素突变菌株UD-17。该菌株维生素B1、B2、B6、烟酸含量分别为137.52、96.46、45.78、563.96（单位:μg/g），其中维生素B2含量比出发菌株高48.22％，烟酸含量提高38.50％。B族维生素总含量达到843.72μg/g，比出发菌株高29.07％，而生物量提高15.01％，达到9.04g/L。 (4)首先，对突变菌株UD-17摇瓶发酵条件进行优化，得到最适发酵条件为:接种量10％、转速150r/min、最适温度30℃、装液量20％、pH6.0。其次，培养基优化的单因素实验结果表明，最适碳源为葡萄糖，最适氮源为胰蛋白胨，最适磷酸盐为(磷酸氢二钾∶磷酸二氢钾=1mol∶1mol)。然后根据单因素实验结果，在培养基中加入七水硫酸镁，进行L9(34)正交优化实验，确定出最适培养基配方为:葡萄糖20.0g/L，胰蛋白胨15.0g/L，磷酸盐(磷酸氢二钾∶磷酸二氢钾=1mol∶1mol)0.48g/L，七水合硫酸镁0.75g/L。在最适发酵及培养基条件下，菌株的生物量增加到12.96g/L，比优化前提高43.36％，维生素B1、B2、B6、烟酸含量分别为152.65、113.94、56.13、658.67(单位:μg/g)，B族维生素总含量达到981.39μg/g，提高16.32％。 (5)首先采用5L发酵罐进行分批发酵，得到该菌株最大生物量为18.38g/L，B族维生素浓度为18.04mg/L。随后，初步探索补加碳源、氮源、微量元素对细胞生物量及B族维生素浓度的影响:①当批次补加碳源时最大生物量为34.89g/L，最大B族维生素浓度为32.19mg/L。比分批发酵生物量提高89.83％，而B族维生素浓度提高87.36％。②当批次补加氮源时生物量达到21.24g/L，B族维生素浓度达到20.57mg/L。相比分批发酵生物量提高15.56％，B族维生素浓度提高14.02％。③当批次补加微量元素时生物量达到20.19g/L，比分批发酵提高9.85％，B族维生素浓度达到最大值22.62mg/L，比分批发酵提高25.39％。
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