摘要
人类社会步入21世纪后，针对各类肿瘤、癌症及心血管病等的大量研究提升了这些疾患的防治水平。但是对于意外突发事件造成的创伤，尤其是在颅脑创伤方面相对缺乏研究进展，使得颅脑创伤成为了人类社会，尤其是发达经济体社会的大敌。颅脑创伤的致死率高，且致残后会严重降低患者的生活质量。目前的共识是，颅脑创伤可分成两个阶段，即原发性损伤阶段和继发性损伤阶段。其中，继发性损伤是可干预的主要环节，而该环节的一个重要方面是炎症反应。除了中枢神经系统固有的免疫细胞会参与颅脑创伤的炎症反应外，外周浸润免疫细胞是另一重要的参与者。学术界已对前者研究颇深，但是对后者鲜有进一步的研究。而在浸润脑实质的外周免疫细胞中，充当急先锋且数量占绝大多数的是中性粒细胞。因此，亟待探讨在颅脑创伤发生后，外周中性粒细胞是如何穿越血脑屏障进入脑实质发挥作用的。课题组通过前期的预实验的筛选，将研究重点放在了代谢型谷氨酸受体5这一分子对颅脑创伤后中性粒细胞的调控功能上。 课题组采用控制性皮层撞击法分别构建了WT小鼠TBI模型和KO小鼠TBI模型，在TBI后24h、3天、7天和14天后分别对应比较了小鼠之间的神经功能学评分情况。然后针对急性期内的TBI后24h时间点进行了重点研究，比对了WT小鼠和KO小鼠的脑切片的HE染色、中性粒细胞标志物免疫荧光、伊文思蓝渗出荧光，以及血管内皮细胞标志物和紧密连接蛋白标志物双标免疫荧光的情况，并对脑组织炎症因子的含量进行测量及比较。接下来，为了筛选出影响中性粒细胞穿越血脑屏障的相关分子，分别使用qPCR和基因芯片对来自WT小鼠或KO小鼠的脑微血管内皮细胞和中性粒细胞进行了检测和比较。除了功能研究外，还用免疫荧光和流式细胞计数法对TBI之前WT小鼠与KO小鼠外周中性粒细胞的数量进行了比较。然后，在体外同样证实了在体内发现的受代谢型谷氨酸受体5调控的相关分子表达情况，并在体外血脑屏障模型中使用代谢型谷氨酸受体5拮抗剂观测了中性粒细胞的穿越情况。在研究了参与该过程调控的信号通路之后，最后通过移植实验重点比较了急性期内TBI后WT移植WT组和KO移植WT组的神经行为学表现情况。 主要实验结果及结论: 1、在隆加评分中，TBI急性期内的KO小鼠与WT小鼠无明显差异。改良的神经功能缺损评分结果显示，TBI后第3天KO小鼠评分低于WT小鼠，敲除代谢型谷氨酸受体5起保护作用。后肢失足实验中，TBI后第3天KO小鼠失足数少于WT小鼠，同样说明敲除代谢型谷氨酸受体5起保护作用。在急性损伤期峰值所处的24h时间点，KO小鼠脑伤处的渗血及免疫细胞的渗出，尤其是CD177阳性的中性粒细胞数量少于WT小鼠脑伤处。TBI后24h的脑组织炎症介质的IL-1β和TNF-α的mRNA表达量也是KO小鼠低于WT小鼠的。血脑屏障功能方面，TBI后24h的伊文思蓝渗出情况是KO小鼠少于WT小鼠的，而此时KO小鼠的紧密连接蛋白claudin-5较WT小鼠而言分布更密集连续。而在TBI之前，脑含水量、呼吸频率和体重在KO正常小鼠和WT正常小鼠之间未发现差异。 2、在TBI后24h后，KO小鼠脑组织趋化因子CXCL1、CXCL2、CCL2、CCL4和CCL5的mRNA的表达量低于WT小鼠。而中性粒细胞的基因芯片结果显示，KO小鼠的趋化因子和趋化因子受体分子表达也是明显低于WT小鼠的。在TBI之前，在KO正常小鼠和WT正常小鼠的外周血中性粒细胞和骨髓中性粒细胞之间未发现数量上的差别。在使用脑微血管内皮细胞建立起的划痕模型当中，致伤24h后特异性拮抗剂MPEP预处理的划痕组的CXCL1、CXCL2、CCL2、CCL4和CCL5的mRNA表达量低于单纯划痕组。在单层脑微血管内皮细胞构建的体外血脑屏障划痕模型中，致伤6h后MPEP预处理的划痕组的EGFP标记中性粒细胞穿越数量低于单纯划痕组。使用PKC抑制剂GF109203X证实PKC通路参与了代谢型谷氨酸受体5对CXCL1、CXCL2、CCL2和CCL4的调控。另外，在WT小鼠TBI后24h骨髓中性粒细胞诱导表达的代谢型谷氨酸受体5的mRNA达到峰值，此后明显下降，至TBI后第14天降至约初始生理水平。最后，在骨髓移植实验中，TBI后第3天KO移植WT组的隆加评分分数及后肢失足次数少于WT移植WT组，而TBI后第1天和第3天KO移植WT组的改良神经功能缺损评分分数低于WT移植WT组。 以上结果说明:敲除代谢型谷氨酸受体5对小鼠TBI急性期具有保护作用，可能是与更少的中性粒细胞浸润和炎症介质表达以及更完整的血脑屏障功能有关。脑微血管内皮细胞和中性粒细胞在以上的效应中扮演重要角色，两者的趋化因子相关分子的表达在KO小鼠中相对更少。在体外血脑屏障模型中，拮抗代谢型谷氨酸受体5能够减少脑微血管内皮细胞层划痕致伤后的中性粒细胞的穿越，印证了动物实验的结果。而最后的移植实验确认了敲除外周骨髓细胞的代谢型谷氨酸受体5对中枢系统的保护作用。课题组的研究成果可对今后基于代谢型谷氨酸受体5的靶向治疗TBI领域提供一定的理论依据。
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