摘要
2型糖尿病（Type2Diabetes Mellitus，T2DM）的发生发展与脂质代谢异常及外周组织非感染性低度炎症密切相关。脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein4，FABP4)被证实在脂质代谢过程和炎症反应中发挥重要作用，通过可逆性结合脂肪酸及其它疏水性配体影响其在细胞内定位，以及通过蛋白间直接相互作用形成脂肪酸信号的传感器，成为调节胰岛素敏感性以及联系炎症与脂质代谢的关键因子。FABP4也可分泌入血，临床和流行病学研究表明，血清FABP4浓度与肥胖相关疾病如T2DM及心血管疾病等均有密切关联，是血清中的重要生物标记物。诸多研究发现FABP4敲除或抑制可以给基因缺陷或高脂饮食诱导的肥胖糖尿病小鼠带来一系列的代谢改善作用，使FABP4成为具有极大潜力的预防和治疗T2DM等的药物靶标。目前已有上百个FABP4抑制剂被报道，靶向肥胖、高脂血症、T2DM、动脉粥样硬化等，但尚未有进入临床阶段的药物。鉴于FABP4在机体代谢过程中发挥的重要作用，开发安全有效的FABP4抑制剂已成为近年来的研究热点。 利用实验室稳定的FABP4体外活性及选择性筛选平台，我们筛选得到一系列活性及选择性良好的FABP4抑制剂，其中部分化合物对FABP4的抑制活性强于已进入临床前的化合物BMS309403。我们选择其中两个化合物16dk和16do进行深入研究，发现两化合物可显著抑制成熟脂肪细胞脂解，促进前脂肪细胞分化过程中脂质生成，这与FABP4敲除鼠脂肪细胞表型一致;在自发肥胖糖尿病db/db小鼠上的初步药效学评价结果显示，两化合物可降低db/db小鼠空腹血糖，增加机体胰岛素敏感性，并能明显降低血清三酰甘油及游离脂肪酸水平;组织切片染色及蛋白免疫印迹结果显示两化合物减轻了db/db小鼠肝脏脂质浸润及肝脏和脂肪组织炎症浸润，改善了肝脏胰岛素抵抗。综上，我们发现了一类活性及选择性良好的FABP4抑制剂，可显著抑制脂肪细胞脂解和改善肥胖糖尿病小鼠的糖脂代谢紊乱及胰岛素抵抗。 有研究表明FABP4敲除小鼠脂肪组织FABP5会代偿性升高，FABP4和FABP5双基因敲除小鼠比FABP4或FABP5单基因敲除小鼠更明显地改善了饮食诱导的肥胖、胰岛素抵抗、T2DM和脂肪肝等症状，FABP4/5双靶抑制剂的研发逐渐成为主流方向，因此我们后期将研究重点转向对FABP4/5双靶抑制剂的研发。经过对药物化学合作组针对先导化合物16dk结构改造合成的上百个化合物进行体外活性筛选，发现部分化合物在保持甚至增加FABP4抑制活性的同时，也出现了对FABP5的抑制作用。我们选择其中两个对FABP4/5抑制活性均较好的化合物A16和B8在细胞水平进行了初步评价，发现两化合物显著抑制了成熟脂肪细胞脂解，效果强于仅有FABP4抑制活性的先导化合物16dk;同时在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的巨噬细胞炎症模型上进行评价，发现两化合物显著降低了炎症基因单核细胞趋化因子-1(monocyte chemoattractant protein-，MCP-1)，肿瘤坏死因子-α(tumor-necrosis factor-α，TNF-α)，白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和环氧和酶-2（cyclooxygenase2，COX-2）的表达，其效果也强于先导化合物16dk;初步的炎症通路研究发现两化合物通过IKK/NF-κB发挥抗炎作用。以上结果提示FABP4/5双重抑制活性化合物比单纯的FABP4抑制剂药效更好，后续将提高药代稳定性后进行在体药效和机制的深入研究。 在论文的最后部分，我们着重于对分泌型FABP4进行机制探索。分泌型FABP4是近年来的研究热点，虽起步较晚但进展迅速。实验室前期研究发现db/db肥胖糖尿病小鼠血清FABP4含量明显高于正常同窝瘦鼠，FABP4抑制剂I-9在db/db肥胖糖尿病小鼠给药4周后表现出良好的改善小鼠糖脂代谢及高胰岛素血症的作用，还显著降低了血清FABP4含量;在后续的研究中我们发现I-9有增加外周组织胰岛素敏感性，及降低外周组织炎症的作用;I-9还增强了db/db小鼠肝脏和脂肪组织自噬水平、减少了肝脏组织脂质浸润。结合目前最新研究报道，我们推测:FABP4抑制剂发挥作用至少部分通过影响分泌型FABP4发生的，分泌型FABP4除了行使其转运脂肪酸的功能外，还可能对外周组织功能和糖脂代谢产生直接的影响;FABP4抑制剂发挥作用一方面可能抑制了FABP4的分泌从而降低了血和组织FABP4的含量，另一方面可能阻断分泌型FABP4对组织细胞的直接作用而发挥其药效。为了证实我们的猜想，首先利用分化成熟的3T3-L1脂肪细胞研究FABP4抑制剂对FABP4分泌的影响，结果显示I-9显著抑制了成熟脂肪细胞分泌FABP4。接着利用重组FABP4蛋白作为分泌型FABP4，分别在肝细胞和脂肪细胞上构建了分泌型FABP4诱导的体外病态模型，结果显示分泌型FABP4诱导了原代肝细胞脂质聚集及胰岛素抵抗，进一步的机制研究中发现自噬在这个过程中发挥了重要的调控作用;分泌型FABP4还通过负调控PPARγ抑制了3T3-L1前脂肪细胞分化，并促进了p38MAPK通路介导的成熟脂肪细胞脂解和炎症反应。最后我们模拟高FABP4血症，利用高浓度重组FABP4蛋白短期注射C57BL/KsJ小鼠对分泌型FABP4的作用进行了一些在体验证，发现注射重组FABP4蛋白2周后小鼠糖促胰岛素释放增加，肝脏组织出现自噬损伤、脂质聚集及胰岛素抵抗，脂肪组织显现炎症，与细胞水平结果一致;而FABP4抑制剂I-9可以部分拮抗分泌型FABP4诱导小鼠出现的上述改变，展现出对分泌型FABP4诱导代谢紊乱的改善作用。综上，我们的研究部分阐明了分泌型FABP4在代谢紊乱病理生理变化中的作用及机制，对其作为代谢相关疾病预测或治疗的药物靶点可行性具有重要意义。
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