摘要
随着经济发展和人们生活方式的改变，糖尿病的发病呈逐年迅速上升的趋势。与之伴随而来的是糖尿病合并其他类型疾病给各专科的治疗带来了严峻的挑战。有研究发现87％的糖尿病患者骨折后愈合时间会延长，骨不连、再脱位的风险会增加3.4倍，给患者带来生理、心理上巨大创伤，也给家人和社会带来额外的经济负担。因此，如何针对糖尿病患者进行骨创伤治疗，缩短糖尿病患者骨折愈合时间，提高患者骨折愈合能力是临床上急需解决的问题。 近年来干细胞来源外泌体(MSC-Exosome)已经成为组织修复新热点，研究发现干细胞来源外泌体在组织修复领域具有巨大潜能，能够促进多种组织损伤的修复。有研究发现将MSC条件培养基用于糖尿病大鼠骨缺损模型，可以促进腓骨骨缺损处组织生长和血管生成，但是条件培养基内何种因素产生主要作用仍不十分清楚。因而推测：MSC条件培养基内外泌体可能是其能够促进糖尿病骨折愈合的主要原因。因此，提取MSC源性外泌体，探究外泌体能否改善对高糖环境对骨相关细胞的负向影响，构造糖尿病大鼠骨缺损模型，评估MSC源性外泌体加速糖尿病大鼠骨缺损愈合的能力。 目的： 提取鉴定间充质干细胞来源外泌体，观察对高糖环境骨相关细胞的治疗作用，对糖尿病大鼠骨缺损模型的促进愈合能力，初步探讨对糖尿病大鼠骨加速愈合的作用机制。 方法： 1.全骨髓培养法培养原代间充质干细胞，光学显微镜进行形态学观察和流式细胞术进行细胞表面标志鉴定。 2.应用改良凝胶排阻法进行外泌体的收集和储存;透射电镜(TEM)进行形态学观察、粒径分析仪检测颗粒大小、Western Blot进行表面标记鉴定。 3.高糖环境下培养成骨细胞和间充质干细胞，将所提取外泌体与两种细胞分别共培养，利用CCK-8和划痕实验检测细胞增殖能力和迁移能力。 4.构建大鼠Ⅰ型糖尿病股骨缺损模型，原位注射所提取外泌体，利用Micro-CT对骨缺损分析和三维重建，检测外泌体对Ⅰ型糖尿病大鼠骨缺损的作用。 结果： 1.原代提取骨髓间充质干细胞显微镜下呈成纤维细胞样梭形细胞，流式细胞检测结果CD90(+),CD105(+),CD34(-),CD45(-)。 2.透射电镜观察可见外泌体成双层囊状外观散在分布，粒径分析显示外泌体直径大小分布在30nm-130nm，Western blot结果CD9(+)、CD63(+)。 3.MSC源性外泌体能够促进高糖环境下干细胞自身增殖(P＜0.05)和迁移能力(P＜0.05)，而对成骨细胞的增殖(P＞0.05)和迁移能力没有影响(P＞0.05)。 4.MSC源性外泌体能够加速糖尿病大鼠骨缺损愈合，促进骨生成，增加缺损处骨痂形成和骨密度。 结论： 1.成功提取原代骨髓间充质干细胞及其外泌体，经鉴定后符合间充质干细胞和外泌体的鉴定表征，可用于进一步实验。 2.间充质干细胞来源外泌体能够提高高糖环境下间充质干细胞自身的增殖能力和迁移能力，而对成骨细胞增殖迁移能力未见显著影响。 3.间充质干细胞来源外泌体能够加速Ⅰ型糖尿病大鼠骨缺损愈合，促进骨生成，增加缺损处骨痂形成和骨密度。
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