摘要
肺癌是全世界范围内发病率和致死率最高的肿瘤，是人类健康巨大的威胁。表皮生长因子受体(EGFR)是非小细胞肺癌(NSCLC)治疗中最成功的靶点，EGFR抑制剂经历了一代抑制剂的里程碑式成功、以及难以避免的耐药问题困扰，逐步开发出能够克服EGFRT790M耐药突变的二代和三代抑制剂。三代抑制剂的代表药物为奥希替尼(osimertinib，AZ9291)，其选择性抑制T790M耐药突变、以及EGFR敏感突变(如第19外显子745-750位点缺失(exon19deletion，19del)和第858位点突变L858R)，而对野生型EGFR抑制较弱。Osimertinib于2015年在美国上市，并快速地于2017年在中国上市。随着EGFR三代抑制剂的深入研究和使用，发现病人在使用osimertinib后逐渐出现耐药，EGFR发生二次突变为最重要的耐药原因，其中C797S点突变最为常见约占22％-24.7％，其次为L792F/H和L718Q突变。能够克服C797S突变的的新型抑制剂（也被称为四代抑制剂）成为新的临床需求，该类抑制剂研究尚比较有限，尚无化合物进入临床研究。因此，开发新型EGFR四代抑制剂成为迫切临床需求。 目前EGFR四代抑制剂研究尚缺乏系统性筛选平台，这也是制约该类抑制剂研发的瓶颈问题。完善的研究平台应包括体外和体内研究平台，涵盖激酶活性体外检测方法、含EGFRC797S突变细胞的构建和培养，以及相应小鼠体内模型的构建。其中，最关键的难点在于尚无商品化的含EGFRC797S突变的细胞株，肿瘤病人来源的含EGFRC797S突变的细胞(patient derived cells，PDC)难以体外培养、且难以在小鼠体内成瘤。因此，构建含EGFRC797S突变的肿瘤细胞株和工具细胞株，是构建该平台并进行四代抑制剂筛选和研究的关键，不仅可用于抑制剂的细胞水平活性评价，也为建立动物模型奠定基础。 在此背景下，本课题主要围绕靶向C797S突变抑制剂开展研究，一方面系统性构建靶向EGFRC797S突变的四代抑制剂筛选平台，包括激酶水平筛选方法、利用CRISPR/Cas9技术构建含C797S突变的细胞、以及用该细胞构建相应的体内模型。另一方面，与化学家合作设计、合成靶向EGFRC797S突变的新型结构化合物，利用所构建的平台进行活性筛选和评价，以期得到具有高活性、高选择性的化合物，为开发具有自主知识产权的EGFR四代抑制剂奠定基础。 一、构建靶向EGFR19del/T790M/C797S抑制剂的激酶、细胞和动物筛选平台，并围绕L792F/H和L718Q突变开展初步平台构建 1.构建靶向EGFRC797S三突变的四代抑制剂筛选平台 (1)构建激酶筛选平台 基于酶联免疫吸附法(ELISA)构建了EGFRC797S三突变激酶（包括EGFR19del/T790M/C797S和EGFRL858R/T790M/C797S）抑制剂的分子水平筛选方法。 (2)构建含EGFRC797S三突变的细胞筛选平台 该平台构建包括工具细胞的构建和肿瘤细胞构建，其中团队在前期已构建高表达EGFR19del/T790M/C797S或EGFRL858R/T790M/C797S的BaF3工具细胞株。本课题中，我们选择在PC9肿瘤细胞株（含19del敏感突变）中，采用CRIPSR/Cas9技术进行基因敲入，同时引入T790M和C797S突变，构建含EGFR19del/T790M/C797S突变的肿瘤细胞。 我们摸索优化转染体系，设计sgRNA，进行转染，并使用AZD9291进行初步筛选，获得AZD9291耐药细胞群。进而根据基因组和mRNA测序结果，获得一个完全表达EGFR19del/T790M/C797S突变的的单克隆细胞。对该细胞EGFR蛋白进行质谱测序，结果显示EGFR蛋白为含有T790M和C797S的EGFR，至此我们成功构建了含EGFR19del/T790M/C797S突变的肿瘤细胞株，命名为PC9-OR(osimertinib resistance)。随后我们采用EGFR三代及四代抑制剂在PC9-OR细胞开展靶点抑制作用检测，以及增殖抑制敏感性检测，结果显示四代抑制剂对PC9-OR的靶点激活和增殖均有和文献相符的抑制活性，而三代抑制剂则都无抑制效果，进一步表明PC9-OR细胞筛选平台敏感可靠，可用于进一步研究。 (3)动物水平筛选平台 我们将PC9-OR细胞接种于裸小鼠皮下成瘤，并证实EGFR四代抑制剂可明显抑制移植瘤生长，而三代抑制剂对移植瘤生长无抑制作用，我们成功构建了靶向EGFRC797S抑制剂的体内研究模型，可用于该类抑制剂的筛选和活性研究。 2.围绕L792F/H和L718Q突变展开初步平台构建 除了C797S突变之外，我们同时关注介导EGFR三代抑制剂耐药的L792F/H和L718Q突变，初步进行了含突变的工具细胞和肿瘤细胞的构建。(1)工具细胞株:在课题组前期已建立EGFR19del/T790M/L781Q工具细胞株的基础上，本课题在BaF3工具细胞株上使用逆转录病毒介导的高表达技术分别引入EGFR19del/T790M/L792F和EGFR19del/T790M/L792H突变，并使用Western blotting和基因组测序验证正确。(2)肿瘤细胞株:在PC9细胞株上同时敲入T790M和L792F/H，同时在在PC9-VanR细胞株（含有19del和T790M突变）上敲入L718Q，此项工作目前正在进行中。所构建的含有EGFRL792H、EGFRL792F或EGFRL7918Q突变的工具细胞和肿瘤细胞，为靶向抑制剂的研发奠定基础。 二、和化学家合作进行抑制剂合成、活性筛选和评价 我们与暨南大学丁克课题组合作，设计合成新型潜在EGFR四代抑制剂近百个，利用所构建的分子水平筛选平台进行筛选及活性评价，得到26个高活性化合物(IC50＜10nM)。结合化合物结构特性、合成路线及理化性质等，选取代表性高活性化合物LS2-106进行后续研究。LS2-106可以强效抑制EGFR19del/T790M/C797S和EGFRL858R/T790M/C797S激酶活性，IC50分别为1.6nM和3.1nM，并且对野生型EGFR激酶抑制较弱，显示出良好的有效性和选择性。在细胞水平上，LS2-106可以有效抑制PC9-OR细胞和表达EGFR19del/T790M/C797S或EGFRL858R/T790M/C797S突变的工具细胞株的体外增殖，其IC50分别为87nM，69nM和91nM，并且可以剂量依赖性地抑制细胞内靶点的活化。我们在SD大鼠上检测了LS2-106的初步药代动力学特征，结果显示LS2-106具有良好的药代特性。进而在PC9-OR移植瘤模型的检测结果显示，LS2-106每天一次腹腔给药可剂量依赖性抑制PC9-OR移植瘤的生长，60mg/kg剂量组连续给药14天T/C为58.87％。 综上，本课题构建了靶向EGFRC797S抑制剂的分子筛选平台，并构建含EGFR19del/T790M/C797S的肿瘤细胞株，以此建立了EGFR四代抑制剂细胞和动物筛选平台。并与化学家合作，设计合成靶向C797S突变的新结构化合物，通过筛选和活性研究，初步获得高活性化合物，为后续四代抑制剂开发鉴定基础。同时，我们在工具细胞株上引入L792F/H和L718Q突变，并且正在向肿瘤细胞引入L792F/H和L718Q突变，为克服该突变抑制剂的研发奠定基础。
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