摘要
顺铂是临床上广泛使用的抗癌药物，其抗癌活性的发现和临床应用开辟了金属抗癌药物研究的先河，也标志着生物无机化学的崛起。顺铂等铂类药物的最终作用靶标为细胞核内的DNA，对DNA的损伤是顺铂发挥抗癌活性的主要途径。当细胞核内的DNA遭受顺铂损伤后，损伤感应相关蛋白会识别该损伤，随之激活相应信号转导通路使细胞周期阻滞，然后DNA损伤修复蛋白会尝试修复该损伤。如果修复失败，细胞就会启动凋亡程序，那么顺铂就发挥了抗癌活性;如果修复成功，细胞会重新进入细胞周期，继续存活并产生顺铂耐药性。因此，介导细胞对铂损伤DNA应答的蛋白对顺铂的抗癌活性有着重要的影响，而从分子水平上研究顺铂损伤DNA的细胞应答将有助于更深入地理解顺铂的作用机制以及细胞对顺铂的耐药机制，促进提高现有药物的疗效并优化设计新的金属抗癌药物。 目前顺铂损伤DNA应答蛋白的捕获方法有亲和柱富集技术、光交联技术和纳米亲和探针技术。每种方法都有各自的优缺点，在保留这些优点的前提下，有必要发展一些新的捕获材料和方法以提高灵敏度、简化操作流程、易于设置阴性对照实验，从而高效、可靠地获得特异性识别损伤DNA的蛋白质。另外，基于软电离技术的质谱分析具有灵敏度高、耗样量少、化学特异性高、能与多种分离技术联用处理复杂样品等优点，已经成为研究金属抗癌化合物与DNA的相互作用和鉴定铂类药物损伤DNA应答蛋白质的重要手段。本论文主要围绕抗癌药物顺铂，建立了基于质谱的分析方法，研究了顺铂损伤双链DNA和人端粒DNA的应答蛋白质、细胞对顺铂的耐药机制以及顺铂与DNA的相互作用，主要研究成果如下: (1)综合点击化学反应和磁性纳米颗粒的优点发展了一种磁性纳米亲和探针技术，从人乳腺癌细胞全蛋白提取液中捕获识别顺铂交联双链DNA的蛋白质，然后结合基于质谱和稳定同位素标记的定量蛋白质组学方法鉴定顺铂交联DNA的特异性应答蛋白。由于点击化学反应优良的生物正交性和该反应生成共价、化学惰性的三氮唑连接基团，以及磁性纳米颗粒无需使用高浓度NaCl进行老化的性质，这种亲和探针非常稳定，不易受到蛋白提取液中其他物质的干扰和破坏。另外磁性纳米颗粒不仅保留了纳米颗粒的优点，还使得探针的分离非常简便、快速、温和。应用这种基于磁性纳米亲和探针和质谱的蛋白质组学方法，鉴定出了之前被广泛报道特异性识别顺铂交联DNA的HMGB蛋白，并发现了一些新的具有RNA或者单链DNA结合能力的顺铂损伤DNA应答蛋白(hnRNP A/B，RRP44，RL30，RL13和NCL)。此外，首次观察到因顺铂损伤DNA而对DNA的结合亲和力下降的蛋白质，如转录因子TFIIFa。这些研究结果不仅提醒关注这些蛋白在应答顺铂损伤DNA过程中的重要性，也拓宽了顺铂损伤DNA应答蛋白的范畴，证实了这种方法的准确性、可靠性和高效性。 (2)将建立的基于磁性纳米亲和探针和质谱的蛋白质组学方法应用于研究顺铂耐药肺癌细胞和顺铂敏感肺癌细胞在顺铂损伤DNA应答蛋白质上的差异，有助于更直接、精确地阐述复杂的顺铂获得性耐药机制。发现了许多与顺铂耐药相关的顺铂-DNA损伤应答蛋白，包括DNA损伤修复相关蛋白(DDB1、NPM1等)、分子伴侣蛋白（HSP90α、HSP90β等）、细胞周期相关蛋白(LMNA、Ki-67等)、RNA结合蛋白（hnRNPM、PAIRB等）、HMGB1、BCLAF1蛋白等，这些蛋白在耐药细胞中的差异性表达和对顺铂损伤DNA的差异性应答导致了非小细胞肺癌细胞的获得性顺铂耐药。对这些蛋白的干预，如抑制DNA修复，可能有助于克服肺癌细胞的顺铂耐药性。 (3)将建立的基于磁性纳米亲和探针和质谱的蛋白质组学方法应用于捕获和鉴定顺铂损伤人端粒DNA的应答蛋白质，并研究顺铂损伤对端粒DNA与端粒相关蛋白结合的影响。比较了六种顺铂损伤/未损伤端粒DNA（即顺铂损伤/未损伤人端粒单链DNA和钠盐/钾盐退火人端粒G-四链体DNA）的结合蛋白种类和结合量，发现了一些共同的变化规律并进行了合理的分析和讨论。同时也鉴定出了一些新的端粒单链DNA结合蛋白（YB-1、SFPQ等）、G-四链体DNA结合蛋白(TAF15、NM23-H1)和特异性识别顺铂损伤G-四链体的蛋白质(AIFM1、PC4)。这些蛋白与端粒单链DNA和G-四链体的结合可能参与调节端粒稳定性和细胞寿命，而顺铂损伤对这些蛋白与端粒DNA相互作用的影响以及那些特异性识别顺铂损伤端粒DNA的蛋白质可能参与顺铂作用机制、介导顺铂的抗癌活性或耐药性。 (4)使用傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICR MS)研究了顺铂与一条15-mer富C、T的脱氧寡核苷酸单链(5'-CCTT4CTT7G8C9T10TCTCC-3'，ODN15)的相互作用，并结合top-down方法鉴定出顺铂在ODN15上的结合位点。碰撞诱导解离(CID)碎裂单铂化和双铂化ODN15产生了丰富的含铂和不含铂碎片离子，使得能够清楚地鉴定出顺铂与O DN15上的T4、T7、C9和T10结合位点。进一步使用分子模拟技术比较了顺铂结合在不同碱基位点对ODN15构象的扭曲情况，并构建和分析了顺铂与胞嘧啶、胸腺嘧啶结合的分子模型。该研究首次使用FT-ICR MS在寡核苷酸水平上观察到了顺铂与胸腺嘧啶、胞嘧啶的结合，也证明了FT-ICR MS在研究金属配合物与生物大分子相互作用中的优越性。
NETL