摘要
微生物发酵技术对于缓解能源危机、推动社会可持续发展具有重要的作用，而糖原料的供应是微生物发酵的必要基础。蓝细菌是一类能够进行光合作用的原核微生物，具有生长速度快、遗传操作简单等优势。许多蓝细菌在盐胁迫下能够合成蔗糖作为相容性物质以抵抗逆境。因此，以蓝细菌为细胞工厂，光驱固碳合成蔗糖为扩展发酵生产领域的糖原料来源提供了新的思路。尽管通过多种基因工程手段已能大幅提高蓝细菌的蔗糖产量，但是进一步提高蔗糖产量变得非常困难，其原因之一是蓝细菌盐胁迫合成蔗糖这一生理过程背后的若干机制未被完全揭示。破解蓝细菌蔗糖合成的诱导和调控机制可以为进一步提高蔗糖产量提供理论依据。本研究围绕聚球藻PCC7942蔗糖合成的诱导调控机制及其代谢工程改造，分四个部分展开研究，主要得到以下结果: 1)以蔗糖分泌型聚球藻PCC7942藻株为出发株，通过茶碱依赖型的核糖体开关实现对糖原合成关键基因glgC的可控表达，构建突变株DY126，并分析盐胁迫下DY126的糖原扰动对蔗糖合成的影响。结果发现糖原水平的下降并没有带来蔗糖合成水平的提升，反而降低了蔗糖产量;而增强糖原的合成，则有效提高了蔗糖的合成。该结果刷新了领域内对糖原的认识:糖原不是蔗糖合成的竞争性途径，而是作为支撑性碳库促进蔗糖的合成。基于此，同时过表达glgC和蔗糖合成的关键基因——蔗糖磷酸合酶的编码基因sps，使蔗糖的产率比原来提高了2.9倍，达到680.4mg/gDcw。（该研究成果已发表:Qiao etal.，Appl Environ Microbiol,2018） 2)系统地敲除聚球藻PCC7942中44个可能的信号转导蛋白的编码基因，构建信号蛋白突变株库，并尝试筛选出与盐诱导蔗糖合成相关的信号转导基因，结果并未发现显著影响蔗糖合成的信号转导蛋白。但是筛选到两个缺失突变后蔗糖合成水平稳定提高的信号蛋白——SYNPCC79421125和SYNPCC7942_1404;并在转录和翻译水平研究其与sps的关系:同时也探索了这两个信号调控蛋白之间可能的互作关系。Synpcc7942_1125和synpcc7942_1404可能是通过影响细胞的基本生理过程（如糖原合成、光合作用等），间接影响了蔗糖的合成。（该研究成果已发表:Qiao et al.，JBasic Microbiol，2019） 3)前期研究表明，盐胁迫条件下，聚球藻PCC7942中蔗糖合成的调控主要发生在SPS酶活水平。SPS的酶活受NaCl诱导激活，同时也可能受DNA的抑制作用。对SPS进行体内荧光定位实验结果表明，SPS和DNA存在动态的互作关系:在非盐胁迫条件下，SPS与DNA结合;在盐胁迫下，SPS和DNA发生分离;当将藻细胞转移到无盐条件时，SPS和DNA又重新结合在一起。SPS的糖基转移酶结构域(GTD)可能在SPS和DNA的互作中起着关键的作用。 4)在聚球藻PCC7942中，SPS是由糖基转移酶结构域(GTD)和磷酸水解酶结构域(PHD)组成的双功能酶。通过对SPS点突变，鉴定出三个关键活性位点:E356、E364和D473。将SPS中PHD结构域的关键氨基酸残基D473进行点突变(D473A)，结果发现突变株丧失了PHD催化活性，蔗糖合成受到严重抑制;而且突变株在盐胁迫下许多生理表型均受到影响，如细胞生长、色素合成、光合能力和细胞代谢等;盐胁迫条件下，D473A点突变还会改变细胞的碳分配，与野生型相比，D473A突变株的三羧酸循环合成减弱，流向糖原和蔗糖方向的碳流增加。突变株胞内的蔗糖-6-磷酸的含量比野生型提高了529倍，这可能会抑制相关的生理代谢活动。
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