摘要
鱼类为适应复杂的水体环境进化出一套独特的黏膜免疫系统，其不仅可以作为物理屏障，非特异性抵御病原的入侵，还可以通过产生抗体发挥特异性免疫防御的功能。合适的病原感染模型是研究鱼类黏膜免疫系统的重要工具，刺激隐核虫作为一种危害严重的海水鱼类寄生虫，主要寄生于海水硬骨鱼类皮肤、鳍条和鳃等体表黏膜组织，并可引起鱼类产生特异性免疫应答。因其独特的寄生特点，刺激隐核虫可作为研究鱼类黏膜免疫应答的良好病原模型。因此，开展鱼类抗刺激隐核虫感染黏膜免疫应答的研究，不仅可以揭示鱼类抗刺激隐核虫感染的免疫机制，也可为开发针对该寄生虫病的免疫防控技术提供理论依据。 本研究首先制备了鼠抗石斑鱼IgM多克隆抗体，其可特异性识别石斑鱼血清和黏液中的IgM，同时也可以标记细胞；以此抗体分选的细胞具有淋巴细胞的形态，且表达鱼类IgM阳性B细胞特征性分子标记（IgM、IgD和MHCⅡ）。石斑鱼血清中的IgM主要为四聚体，同时也存在少量二聚体，而黏液中的IgM主要为四聚体。糖基化分析显示石斑鱼IgM重链可发生糖基化。石斑鱼IgM在各组织中表达丰富，其中头肾、脾脏、幽门盲囊及肠道等组织的抗体分泌能力较强，免疫组化也在这些组织中检测到了IgM阳性细胞。此外，还发现头肾白细胞中12.78±0.33%IgM阳性细胞具有吞噬大颗粒的活性。 为研究石斑鱼IgM在抗刺激隐核虫感染免疫中的作用，我们首先构建了刺激隐核虫体表感染石斑鱼免疫模型：经三次免疫后，石斑鱼可抵抗约90%的刺激隐核虫再次感染。经刺激隐核虫免疫后，石斑鱼血清及黏液中的特异性及总IgM水平均显著上升，组织块体外培养试验显示这些IgM可由头肾和皮肤中的抗体分泌细胞进行分泌，且鳃中的IgM抗体分泌细胞在首次感染组及免疫组均显著上升；另外，被动免疫试验证实石斑鱼抗刺激隐核虫特异性IgM可由血液转运至皮肤黏液，暗示系统免疫组织产生的特异性IgM抗体也可转运至黏膜免疫组织参加应答；通过体外和体内的试验均证实IgM可与刺激隐核虫发生特异性结合；对免疫组石斑鱼的IgM进行RNA干扰后，可观察到刺激隐核虫的感染率显著上升，说明IgM参与刺激隐核虫的抗虫免疫。此外，使用重组刺激隐核虫GDCI3蛋白对石斑鱼进行注射免疫，在其血清和黏液中均发现有特异性IgM的产生，说明通过注射的方式同样可以引起石斑鱼黏膜抗虫免疫应答。 为研究鱼类如何通过IgM启动宿主抗虫免疫应答，我们初步开展了石斑鱼BCR信号通路的研究。用鼠抗石斑鱼IgM的抗体刺激后，石斑鱼HKL的钙通量上升，提示石斑鱼具有完整的BCR信号通路；克隆了BCR信号通路6个关键基因，并分析了各基因的组织分布、亚细胞定位、NF-κB的激活等基本信息，发现刺激隐核虫感染可引起BCR信号通路的转录表达差异，推测BCR信号通路在感染后发生激活。制备了BCR信号通路其中一个关键基因——BTK的多克隆抗体，发现钒酸钠/过氧化氢处理可诱导HKL细胞中BTK蛋白发生磷酸化，而Ibrutinib处理则可抑制BTK磷酸化。此外，刺激隐核虫感染可引起鳃和皮肤中的BTK发生磷酸化，说明BTK在刺激隐核虫感染过程中被激活。
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