摘要
爪哇根结线虫（Meloidogynejavanica）为我国南方地区重要的根结线虫，其寄主达2000多种，每年对我国农业生产造成大量损失。在侵染寄主的过程中，爪哇根结线虫通过口针将食道腺分泌的效应蛋白注射到植物细胞内，这类效应蛋白在线虫侵染与寄生过程中起重要作用。对爪哇根结线虫效应蛋白进行分离和鉴定，明确其致病机理，可以为防治根结线虫病害提供理论依据。本文通过同源克隆的方法，从爪哇根结线虫cDNA中分离出一个潜在的效应蛋白Mj-4D01。通过原位杂交，invitroRNAi，龄期表达，亚细胞定位，酵母双杂等方法对该基因进行鉴定，结果如下： 1.通过同源克隆获得了爪哇根结线虫Mj-4D01基因，该基因ORF为525bp，DNA全长为1012bp，含4个内含子区域。该基因编码174aa的氨基酸，BLAST对比表明该蛋白的同源蛋白在根结线虫中普遍存在，与南方根结线虫（M.incognita）食道腺分泌蛋白Mi-MSP3同源性最高，为97%，该蛋白在C端含一个线虫特有的grd-like结构域。SignalP预测该蛋白前24aa为其信号肽。TMHMM分析结果显示，去除信号肽后该蛋白不含跨膜结构域。WoLFPSORTprediction预测该基因有66%的可能定位在细胞核，31%的可能定位在线粒体。 2.以该基因cDNA序列为模板，设计特异探针序列，利用地高辛标记的特异探针，以爪哇根结线虫二龄幼虫为材料，通过原位杂交技术表明该基因在线虫亚腹食道腺特异表达。 3.龄期表达实验表明该基因在爪哇根结线虫侵染前阶段级寄生早期阶段表达量较低，在寄生18天时表达量最高，为卵期表达量的57倍，之后表达量不断下降，在成熟雌虫阶段几乎没有表达，推测该基因在线虫寄生阶段发挥作用。 4.通过合成体外dsRNA浸泡爪哇根结线虫二龄幼虫，相比对照组浸泡dsGFP和ddH2O的结果，dsMj-4D01处理组表达量明显降低，在接种35d后，总侵染数，成熟雌虫数量和成熟雌虫占总虫数比相比对照组均明显下降，说明该基因可能与爪哇根结线虫的寄生有关。 5.将Mj-4D01基因与eGFP融合，通过35s启动子构建植物瞬时表达载体，利用烟草（Nicotianabenthamiana）表达系统，在烟草叶肉细胞中表达蛋白，在荧光显微镜下观察其亚细胞定位，结果表明去除信号肽后该基因在植物质体或线粒体中累积。 6.通过酵母双杂实验，在拟南芥（Arabidopsisthaliana）cDNA文库中筛选出了4个潜在的互作蛋白，通过共转验证得到一个在酵母中互作的植物蛋白里克斯铁硫氧还原蛋白前体物（photosyntheticelectrontransferC，petC）。该蛋白定位在植物质体中，是植物光电子转运重要载体，可能与植物自身免疫防卫反应相关。 综上所述，Mj-4D01是爪哇根结线虫分泌的效应蛋白，在根结线虫寄生阶段发挥作用，可能与植物免疫相关。
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