摘要
磷霉素对多重耐药革兰氏阴性菌具有良好抗菌活性，且具有较低的耐药率而受到人们的重视。尽管磷霉素在我国没有批准用于动物，但在肠杆菌尤其是大肠杆菌已出现磷霉素耐药菌，fosA3自发现以来已成为我国动物源肠杆菌尤其是大肠杆菌中最为流行的质粒介导的磷霉素类耐药基因。鸽子作为食品动物，虽然对抗菌药物的使用有所限制，仍被认为是细菌的潜在储存库，可能对人类公共健康造成威胁。 本研究从广东省佛山市某鸽场采集鸽子及环境样品72份，采用选择性培养基分离细菌，并且通过MALDI-TOF-MS鉴定细菌种属。采用PCR检测分离菌株中磷霉素耐药基因fosA3、fosC2、fosA。结果显示72份样品中共获得108株大肠杆菌（E.coli），22株奇异变形杆菌（P.mirabilis），2株肺炎克雷伯菌（K.pneumoniae），5株普通变形杆菌（P.vulgaris），1株弗氏柠檬酸杆菌（C.freudii），1株斯氏普罗旺斯菌（S.provencal），1株恶臭假单孢杆菌（P.putida），1株产气单胞菌（A.aeruginosa）。其中49株大肠杆菌，16株奇异变形杆菌及1株弗氏柠檬酸杆菌为fosA3阳性，未检出fosC2和fosA基因。 采用琼脂稀释法测定fosA3阳性大肠杆菌及其接合子耐药表型，以及微量肉汤稀释法测定阳性奇异变形杆菌耐药表型。结果显示49株fosA3阳性大肠杆菌都对磷霉素（MIC>256μg/mL）、氨苄西林、头孢噻肟、环丙沙星耐药；此外对四环素、磺胺类药物、氟苯尼考、庆大霉素、黏菌素、阿米卡星耐药率分别为97％、73.47％、38.78％、16.33％、8.20％，2％；但都对氯霉素、美罗培南和替加环素敏感。16株fosA3阳性奇异变形杆菌株均对磷霉素耐药（MIC>256μg/mL），此外还对氨苄西林、头孢噻肟、四环素、替加环素、黏菌素、环丙沙星、氯霉素以及氟苯尼考等8种抗菌药物耐药率为100％，另外对庆大霉素耐药率为18.75％。 采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）、全基因组测序、构建核心基因组进化树以及多位点序列分型（MLST）分析肠杆菌间亲缘关系。PFGE结果显示鸽场存在fosA3阳性大肠杆菌和奇异变形杆菌克隆传播的现象；大肠杆菌MLST结果显示，该鸽场共有9种ST型，其中3种ST型在人源样品中检出，鸽场主要流行的ST型为ST6856（n=12）；挑选不同PFGE谱型菌株进行全基因组测序和进化树分析，发现人源样品分离的菌株与本研究中分离的大肠杆菌和奇异变形杆菌均具有较少的SNP，提示fosA3阳性大肠杆菌与奇异变形杆菌均可能在人和动物间相互传播。 采用接合转移研究fosA3基因的传播机制，结果发现31株大肠杆菌fosA3基因可转移，16株fosA3阳性奇异变形杆菌不能发生接合转移。对fosA3基因阳性的大肠杆菌接合子进行S1-PFGE与Southern杂交，结果显示fosA3基因定位在大小不同的质粒上，质粒大小约为70～380kb。对fosA3基因阳性奇异变形杆菌进行I-CeuIPFGE与Southern杂交，结果发现fosA3定位在奇异变形杆菌的染色体上。 选取不同PFGE谱型fosA3阳性菌株进行全基因组测序，并采用PCR-mapping方法分析对fosA3上下游基因序列，结果显示本研究获得的基因环境与已报道序列相似度为100％，fosA3位于三种不同的基因环境中，其中11株大肠杆菌携带耐药基因遗传结构IS26-?orf2-orf1-fosA3-?IS903D-blaCTX-M-14-IS26；1株大肠杆菌和2株奇异变形杆菌携带耐药基因遗传结构IS26-orf3-?orf2-orf1-fosA3-IS26；4株大肠杆菌携带耐药基因遗传结构IS26-orf3-?orf2-orf1-fosA3-IS26-?IS903D-blaCTX-M-65-?ISEcp1-IS26。 本研究调查了某鸽场肠杆菌中磷霉素耐药基因fosA3的流行与传播特征，发现该鸽场大肠杆菌、奇异变形杆菌中磷霉素耐药基因fosA3存在较高的流行性。大肠杆菌中fosA3基因可通过质粒的水平转移与菌株克隆传播在鸽场多种来源样品之间流行；奇异变形杆菌中fosA3基因主要通过菌株的克隆进行传播。此外，IS26-fosA3-IS26组成的复合转座结构很可能介导fosA3基因在不同肠杆菌的质粒和染色体之间转移，从而加速fosA3基因的散播。本研究针对某鸽场分离细菌磷霉素耐药基因流行及传播特征进行研究，为控制禽源多重耐药菌的传播提供参考依据。
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