摘要
由尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种（Fusariumoxysporumf.sp.cubenserace4，FOC4）引起的香蕉枯萎病是世界范围内的毁灭性的香蕉病害。由于蕉类的广泛种植和该病原菌的土传特性，加之没有持久有效的防治措施，导致该病迅速传播和蔓延，因此在致病机制上对香蕉枯萎病菌进行研究能为该病的有效防控提供理论基础。关于FOC4的致病相关小RNA研究较少，本实验室在前期通过小RNA高通量测序并结合生物信息学分析得到大量小RNA待选序列。为了进一步筛选和鉴定与致病相关的小RNA，本研究应用qRT-PCR的方法从中筛选和确定接种后表达显著上调的小RNA，并以此为目标小RNA对其进行前体片段进行敲除和过表达，通过对突变体的表型分析从而探究这些小RNA在香蕉枯萎病菌致病过程中的作用，主要结果如下： 1.在候选的31条小RNA中，筛选到milR70和milR75两个小RNA在接种寄主后表达量显著上调，这与课题组前期对香蕉枯萎病菌培养状态和接种寄主24h后的小RNA测序结果一致。经RNA前体比对和二级结构预测，发现这两个小RNA分别位于两个基因间，具茎环结构。 2.运用PEG介导原生质体转化，对香蕉枯萎病菌野生型菌株XJZ2分别进行milR70和milR75前体片段的同源重组敲除，经平板筛选和PCR验证获得milR70和milR75前体敲除突变体。 3.对获得的milR70前体敲除突变体进行表型分析，发现突变体相对于野生型菌落气生菌丝稀释、产孢量显著降低。抗逆性实验结果表明milR70前体敲除突变体相对于野生型对刚果红（CR）和荧光增白剂（CFW）不敏感。致病性测试表明，与野生种菌株相比milR70前体敲除突变体对香蕉苗的致病力明显减弱。 4.对获得的milR75前体敲除突变体进行表型分析，发现突变体相对于野生型菌落气生菌丝减少，液体培养时菌丝干重减小，产孢量降低，孢子耐热性降低。抗逆性实验结果表明milR75前体敲除突变体相对于野生型对刚果红（CR）和荧光增白剂（CFW）不敏感。致病性测试表明，与野生种菌株相比milR75前体敲除突变体对香蕉苗的致病力明显减弱。 5.为进一步验证目标小RNA的功能，依据其前体序列，分别构建小RNA过表达载体并转化至香蕉枯萎病菌野生型菌株XJZ2中，经平板筛选和PCR验证筛选到milR70和milR75两个小RNA的过表达突变体。对过表达突变体的表型研究发现突变体在产孢量，气生菌丝生长量，细胞壁敏感性测定，以及致病性方面相对于野生型菌落无显著差异。 上述结果表明，香蕉枯萎病菌FOC4中的milR70，milR75前体参与病原菌的生长、产孢以及对寄主的致病力。
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