摘要
杆状病毒多基因表达系统是继细菌、酵母和哺乳动物细胞等表达系统之后的第四大表达系统。较细菌有更强大的加工后修饰的功能；较酵母有更低的背景干扰；较哺乳动物细胞有更低的成本且操作简便，对设备要求低。杆状病毒多基因表达系统由最初的空斑纯化到MultiBac经过多次改良后变得更为优良，而家蚕易于饲养，成本较低。因此，本研究采用MultiBac与家蚕生物反应器相结合的模式（MultiBac-家蚕生物反应器）表达重组蛋白。 干扰素（interferon,IFN）是一类具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等广泛生物学活性的糖蛋白，其中鸡λ干扰素（chIFN-λ）是Ⅲ型鸡干扰素，其功能性受体主要存在于上皮细胞。非特异性免疫是细菌病毒入侵的第一道屏障，其中皮肤和黏膜起着重要的作用。在抗病毒方面尤为重要。禽白血病（AL）是一种禽传染性疾病，主要由禽白血病病毒（ALV）引起。其中J亚型ALV（ALV-J）具有较高的致病性和传染性，严重的影响了我国养禽业的发展。目前尚无有效的疫苗和药物对AL进行防控。本研究拟借助昆虫MultiBac系统构建稳定表达chIFN-λ的重组杆状病毒，再用家蚕生物反应器对chIFN-λ进行大量表达，并探究其是否具有抗ALV-J的功能。研究获得以下结果： （1）人工合成了chIFN-λ基因，其中信号肽替换为家蚕核型多角体病毒GP64蛋白信号肽，并引入蛋白标签6×His-tag，命名为BmGP64sp-chIFN-λ-His。 （2）以egfp作为荧光报告基因构建转移载体pFBDM-egfp-BmGP64sp-chIFN-λ-His。通过Tn7转座位点构建重组大肠杆菌E.coliBmMultiBac/rSw106-egfp-BmGP64sp-chIFN-λ-His。用E.coliBmMultiBac/rSw106-egfp-BmGP64sp-chIFN-λ-His侵染BmN细胞，待荧光出现，盲传3代，经Western-blot鉴定,结果显示获得可以稳定表达重组chIFN-λ的P3代重组杆状病毒BmNPV-chIFN-λ。 （3）通过原核表达成功表达重组chIFN-λ-His，经SDS-PAGE检测，结果显示重组蛋白是以包涵体形式存在，通过多次洗涤包涵体获得重组chIFN-λ-His粗制品，用弗氏佐剂乳化后多次免疫小鼠获得自制抗chIFN-λ-His小鼠多克隆抗体血清。 （4）将BmNPV-chIFN-λ注射5龄家蚕表达重组chIFN-λ。通过Ni-NTA柱亲和层析纯化重组chIFN-λ，并用自制小鼠抗chIFN-λ多克隆抗体血清鉴定纯化的重组chIFN-λ。经Western-blot鉴定，结果显示重组chIFN-λ纯化成功。经初步活性验证证明重组chIFN-λ在DF1细胞上具有抗病毒活性，其抗病毒活性为3.45×102UI/mL。 （5）qPCR及ELISA结果显示重组chIFN-λ在DF-1及LMH细胞中具有抗ALV-J的功能：经重组chIFN-λ处理后，细胞中干扰素刺激基因如MX、Viperin及IFITM3的转录水平均显著上调。推测重组chIFN-λ可能是通过诱导ISGs的表达而发挥抗ALV-J功能的。 综上所述，本实验利用MultiBac-家蚕生物反应器成功获得大量活性稳定的chIFN-λ，经纯化后检测具有生物活性，且具有显著的抗ALV-J功能。此方法可用于制备和批量生产重组chIFN-λ或其他活性蛋白，具有广阔的研究与应用前景。
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