摘要
目的：氨是机体含氮物质代谢所产生的毒性副产物，也是诱发肝性脑病的主要生物毒素。近期研究发现，氨作为一种新型自噬诱导剂，促进肝细胞自噬的同时，利用自噬改善肝细胞的尿素循环和能量代谢体系以利于细胞存活。孕烷X受体（pregnaneXreceptor，PXR）以及其他核受体家族成员作为转录因子广泛参与机体各种生理活动，也是药物代谢和耐药形成的主要调控者。然而，PXR是否参与氨诱导的自噬以及在这一过程中起到何种作用尚未有研究报道。本研究通过探讨PXR对氨诱导肝细胞自噬的影响以及分子机制，为临床上PXR激活剂类药物的应用提供有价值的参考。 方法：（1）构建PXR过表达（PXR+）和PXR敲低（PXR-）的稳定转染肝细胞株，分别在3mM、5mM、10mM以及15mM氨浓度处理下，通过免疫印迹法检测自噬标志分子LC3B和自噬特异性底物SQSTM1的表达，取最适氨浓度下观察自噬小体/自噬溶酶体的形成，综合判断PXR过表达和敲低后，肝细胞自噬水平变化。（2）分析外源PXR激活剂利福平（Rifampicin）对氨诱导肝细胞自噬水平的影响。（3）通过检测PXR+、PXR?肝细胞株中P53和AMPK各亚基在氨刺激后蛋白表达以磷酸化水平的变化，分析P53/AMPK信号轴在氨诱导后的活化情况以及PXR对P53/AMPK信号轴的影响。（3）构建AMPKβ1启动子全长以及截断片段的荧光素酶报告质粒，双荧光素报告分析P53转录因子对AMPKβ1的调控活性；通过在线转录因子预测软件分析AMPKβ1启动子中P53的潜在结合位点，构建针对该位点的突变报告载体，检测P53在位点突变后的转录激活活性改变，并由ChIP实验检测体内AMPKβ1启动子中P53的直接结合区域。（4）将AMPKβ1启动子共转染P53和/或PXR的表达质粒，由双荧光素报告实验分析PXR对P53转录活性的影响。（5）采用CoIP实验进一步分析内源性PXR与P53的蛋白-蛋白相互作用。 结果：（1）氨诱导后相对于野生株细胞，PXR-肝细胞株中自噬水平增高，表现在LC3B-Ⅱ水平上调，SQSTM1降解增高，而PXR+细胞株的呈相反趋势；此外PXR稳定激活剂Rifampicin也有类似的生物学效应。（2）氨刺激下能量感应分子AMPK中β1亚基及其磷酸化Ser108（p-AMPKβ1）水平在PXR?细胞中明显高于野生型对照细胞；P53的磷酸化也水平也受PXR的调控，表现为PXR敲低后，P53总蛋白与磷酸化蛋白均升高。（3）机制分析发现在AMPKβ1启动子区域的（-253nt~-19nt）存在两个毗邻的P53的结合活性位点，二者同时突变可明显降低P53依赖的AMPKβ1反式激活作用；P53可直接结合于AMPKβ1启动子的（-253nt~-19nt）区域；PXR的表达抑制P53对AMPKβ1的转录调控活性，且二者之间存在蛋白相互作用。 结论：（1）PXR的表达与激活抑制氨诱导的肝细胞自噬。（2）氨特异性激活自噬调控蛋白P53以及AMPKβ1，PXR抑制二者的蛋白表达水平。（3）AMPKβ1启动子（-253nt~-19nt）区域中存在P53的结合位点，正向调控AMPKβ1的转录水平。（4）PXR通过与转录因子P53相互作用，干扰P53对下游靶基因的转录活性，从转录水平下调氨诱导的AMPKβ1表达。
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