摘要
目的非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia，NOA)是男性不育症中常见的疾病类型，其特征为精子发生过程存在异常，但具体的分子机制尚不明确。作为维生素A的活性代谢产物之一的视黄酸(retinoic acid, RA)是调节精子发生过程中不可或缺的因子。RA依靠其受体进行下游活动调节，这些受体可能成为NOA治疗的潜在靶点。然而，由于缺乏精子发生正常以及生精异常患者中视黄酸受体定位及表达的研究，很难制定出针对这一靶点有效的治疗策略。在本研究中，我们研究了精子发生正常以及NOA患者睾丸组织中视黄酸受体(RARA、RARB、RARG、RXRA、RXRB和RXRG)的定位和表达情况，为探索男性不育治疗的新靶点奠定了基础。另外，精子发生是一个复杂调控的生物学进程，是有性生殖过程中是极为重要的一环。在许多精子发生相关研究中，蛋白编码基因、mRNA以及小非编码RNA的作用都得到了很好的印证。然而,在精子发生这一生物学进程中仍存在许多未解之谜。长非编码RNA(long-noncoding RNA, lncRNA)作为新加入非编码RNA家族的新成员，关于其在精子发生中的研究领域还存在大量空白。因此，在第二部分中，我们选择了一条还未被报道过的在小鼠的睾丸组织中特异性表达的lncRNA-lncRNA4667作为研究目标，研究其是否在精子发生的进程以及男性不育的致病过程中起作用。 方法收集精子发生正常及各类型NOA患者的睾丸组织样本，探究视黄酸受体是否存在定位及表达水平差异。通过实时荧光定量PCR分析视黄酸受体转录水平差异，通过免疫组织化学检测其翻译水平差异。在第二部分中，通过原位杂交实验明确lncRNA4667在睾丸中的定位，通过实时荧光定量PCR实验检测lncRNA在各组织中的表达水平。我们使用CRISPR/Cas9技术构建了lncRNA4667基因缺陷小鼠模型。通过比较敲除小鼠与野生雄鼠的附睾及睾丸组织的形态学差异，精子数量、活力以及其他与生殖有关的指标，探讨lncRNA4667在精子发生中所起的作用以及分析对其进行基因敲除后对小鼠的生殖系统造成的影响。 结果在精子发生正常的睾丸组织中，RARA和RARG主要定位于精母细胞和圆形精子细胞，RXRB主要表达于支持细胞，RXRG在大多数细胞类型中表达。NOA患者的RARA、RARG、RXRB、RXRG定位与正常睾丸组织中定位一致。此外，我们发现RARA、RARG、RXRA、RXRB和RXRG的mRNA表达水平在唯支持细胞综合征和成熟停滞的NOA患者中显著降低(P<0.05)。第二部分研究中，我们发现lncRNA4667为睾丸特异性lncRNA,主要定位在成年小鼠睾丸内的圆形精子细胞中。通过成功构建lncRNA4667敲除小鼠模型，我们发现lncRNA4667敲除小鼠精子发生正常，并且可育。 结论1.RARA、RARG、RXRA、RXRB和RXRG在唯支持细胞综合征及生精停滞的NOA患者的睾丸组织中表达量异常降低，提示其可能与精子发生相关。视黄酸受体可以作为新的分子指标，为诊断和治疗这些病理类型的男性不育患者提供新的靶点。 2.lncRNA4667定位在圆形精子细胞，可作为圆形精子细胞的特异性标记物。lncRNA4667不是小鼠精子发生所必须。
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