摘要
脑胶质瘤指起源于脑神经胶质细胞的肿瘤，是神经外科最为常见的原发性颅内恶性肿瘤，它呈浸润性生长，侵袭性强，即使给予术后放疗、化疗或联合治疗，其复发率仍然很高，严重影响患者生存期及生存质量，治疗效果始终不甚理想。胶质瘤的详细发病机制目前仍不是非常清楚，因此进一步探索胶质瘤相关的发生发展机制，探讨如何为未来胶质瘤的治疗取得突破性进展就显得十分有必要。 目前，高分辨基因芯片及人类基因组测序分析显示出人类基因组包含有大约20000个编码蛋白基因，然而绝大多数的人类基因组包含大量的非编码RNA(ncRNA)，这些非编码序列在人类基因组的占比超过98％。非编码RNA根据转录本长度简单分为长链非编码RNA(LncRNA)及小RNA。其中，LncRNA作为当前最火热的该领域研究热点，被发现广泛参与了生物体内从转录到翻译以及RNA降解的多个过程。大量文献均指出，随着高通量基因组测序的快速发展，已经有数千种新的与疾病相关的LncRNAs被明确标记。值得注意的是，越来越多的证据表明LncRNAs可以加速或抑制胶质瘤的发生，另一方面，LncRNAs也可以作为神经胶质瘤的一个有前途的预后标志物。 LncRNALINC00511已被鉴定为人类癌症中的癌基因，例如非小细胞肺癌、乳腺癌和导管腺癌。但在胶质瘤的癌变过程中，其具体机制尚不清楚。我们前期通过搜索筛选TCGA、Oncomine和NCBI的GEO数据库，发现LINC00511在胶质瘤中可能出现特异性的高表达，提示LINC00511在胶质瘤中可能发挥重要的促癌作用。因此，在本研究中，我们旨在进一步探讨LINC00511对胶质瘤癌症表型的影响，以及干涉胶质瘤发生发展的通路或机制。首先，我们收集脑胶质瘤组织标本，研究人脑胶质瘤组织和癌旁脑组织中的LINC00511差异性表达，并与其病理级别相关。发现胶质瘤组织标本中的LINC00511与癌旁脑组织中相比有明显的表达增加，而且随病理级别增高表达越加显著。这充分地说明，高水平的LINC00511表达代表神经胶质瘤患者的不良预后。其次，我们通过细胞体外和体内实验表明，LINC00511能够促进胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力，促进肿瘤的迅速生长。这一系列结论和数据可以证实LINC00511在神经胶质瘤发生和进展中起到癌基因的作用。 进一步对LINC00511上游调控的研究中，我们通过查阅大量文献和在线生物信息学工具(jaspar，)搜索，发现转录因子Sp1可能与LINC00511的启动子区结合，是其潜在的调控因子。设计的验证实验证实了这一点，且研究表明转染Sp1过表达质粒不仅能提高Sp1蛋白的表达水平，也能激活升高LINC00511RNA的转录水平。而Sp1在胶质瘤细胞中的过表达也提示与胶质瘤的预后不良相关。因此，可以说转录因子Sp1诱导加速了胶质瘤细胞中LINC00511的转录表达。 在对LINC00511下游靶基因调控的研究中，有学者报告在胰腺导管腺癌中LINC00511海绵化hsa-miR-29b-3p作为竞争性内源性RNA，调节血管内皮生长因子A的表达，这一发现激发了LINC00511可能通过竞争性内源性RNA来调节胶质瘤进展的灵感。初步实验结果表明，LINC00511的亚细胞分布主要位于细胞质和胞浆中，提示了LINC00511在转录后水平的潜在调控，经生物信息学分析预测及荧光素酶报告基因实验证实，miRNA-124-3p可与LINC005113’-UTR区互补结合，而沉默和过表达LINC00511后miRNA-124-3p表达水平也随之升高和降低，显现出二者明显的竞争性抑制作用。还有文献报道称，在胶质瘤的发生过程中，miRNA-124-3p通过靶蛋白发挥其肿瘤抑制作用。因此，我们设计进一步的实验结果证实，CCND2被LINC00511和miR-124-3p联合调控，而CCND2及其编码的cyclinD2蛋白均可调节加速胶质瘤细胞的进展。 总之，我们的研究发现了在神经胶质瘤细胞中LINC00511的致癌作用，其表达受到转录因子Sp1的诱导调控，而LINC00511的表达上调竞争性地海绵吸附miR-124-3p，抑制了miR-124-3p的表达，从而刺激了CCND2及其编码的cyclinD2蛋白的表达增高，通过靶向miR-124-3p/CCND2轴加速了胶质瘤的进展，这可能为将来的胶质瘤治疗提供一个新的靶点或者希望。 第一部分LINC00511在人脑胶质瘤中的表达变化及其临床意义 目的：研究LINC00511在人脑胶质瘤组织和癌旁脑组织中的差异表达，并探讨LINC00511的表达与胶质瘤WHO病理分级的关系。 方法： 1.胶质瘤标本采集 收集2017.01-2017.12河北医科大学第二医院神经外科接受手术治疗的脑胶质瘤组织标本和癌旁组织标本各45例，将样本编号分为肿瘤组和对照组。标本采集后保存于2ml无菌冻存管，迅速放至液氮中冷冻，低温保存。随访确认病理诊断为胶质细胞瘤，其结果均由2位病理医师根据WHO分级指导得出。 2.提取并检测LINC00511的差异性表达 按照Trizol法提取组织RNA，反转录为cDNA。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)反应方法分别检测组织中LINC00511的相对表达水平，准确记录数据。 3.结果分析 首先将对照组织和肿瘤组织获得的LINC00511表达结果进行分析，之后基于WHO病理分级(I~IV)，整理qRT-PCR结果再次分析其表达水平与病理分级的关系。得到的结果采用GraphPadPrism5进行分析，绘出散点图。 4.检测神经胶质瘤细胞系(SHG44, U87, U251, A172)以及正常人星形胶质细胞(NHA)中LINC00511的差异性表达，并进行结果分析。 5.大样本量分析 我们基于TCGA数据()的Gepia(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)数据集，将胶质瘤样本(n=518)与对照组(n=207)中的LINC00511表达水平对比分析，同时将基于TCGA的总生存率进行统计分析并分别以图例显示。 结果： 1.在组织样本中使用qRT-PCR检测LINC00511的表达，表明胶质瘤组织样本中的LINC00511较癌旁脑组织中相对表达量明显增高，差异具有显著性(P＜0.05)。而且，在高级别病理类型(WHOⅢ-Ⅳ级)中，LINC00511的表达比低级别病理类型(WHOⅠ-Ⅱ级)中上调明显，说明LINC00511的表达水平与脑胶质瘤的WHO病理分级呈明显正相关。 2.细胞学水平检测表明，LINC00511不仅在胶质瘤组织中高度表达，而且在体外神经胶质瘤细胞中同样过表达。 3.在更大的样本量分析中，基于TCGA数据()的Gepia数据集表明，胶质瘤样本(n=518)中的LINC00511表达水平高于对照组(n=207)。基于TCGA数据的总生存率分析显示，LINC00511表达水平较高的患者的生存率较低。以上数据表明LINC00511的过度表达预示胶质瘤患者的临床预后较差。 小结： 1.LINC00511在人脑胶质瘤组织中明显高表达，且其表达水平与脑胶质瘤的WHO病理分级呈正相关，高级别(WHOIII-IV级)胶质瘤LINC00511的表达量明显高于低级别(WHOI-II级)胶质瘤。 2.LINC00511在体外神经胶质瘤细胞系(SHG44, U87, U251, A172)中同样过表达。 3.大样本量分析中，胶质瘤样本(n=518)中的LINC00511表达水平高于对照组(n=207)，总生存率分析显示，LINC00511表达水平较高的患者的生存率较低。 第二部分LINC00511对胶质瘤细胞的增殖、侵袭和肿瘤生长等生物学行为的影响 目的：探讨LINC00511对脑胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭和肿瘤生长的影响。 方法： 1.培养U251和U87细胞系用于体外功能学实验。同时设计针对LINC00511的siRNA。 2.向U251细胞系转染siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3)，以降低细胞内LINC00511的表达，同时设置阴性对照组。向U87细胞系转染LINC00511重组质粒以升高细胞内LINC00511的表达，同时设置阴性对照组。 3.通过平板克隆形成试验检测沉默和过表达LINC00511对胶质瘤细胞增殖的影响。 4.进行CCK-8实验研究沉默和过表达LINC00511后胶质瘤细胞增殖能力的变化。 5.进行Transwell实验研究沉默和过表达LINC00511后胶质瘤细胞侵袭能力的变化。 6.进行裸鼠成瘤实验，通过测量计算肿瘤的体积和重量，研究LINC00511在体内对胶质瘤生长的影响。 结果： 1.成功建立LINC00511沉默的U251细胞模型和过表达的U87细胞模型 qRT-PCR结果显示，U251细胞转染siRNA后，LINC00511的表达量较空白转染组显著降低(P＜0.01)，其中以siRNA1转染后效果最佳。而转染pc-LINC00511重组质粒后，U87细胞内LINC00511的表达量较空白转染组显著升高(P＜0.01)。 2.平板克隆形成试验检测结果 LINC00511过表达后对胶质瘤细胞克隆菌落形成促进作用，而LINC00511沉默之后对胶质瘤细胞克隆菌落形成抑制作用。 3.CCK-8实验结果 经实验检测LINC00511沉默之后的U251细胞和对照细胞不同时期的细胞活力，以及LINC00511过表达的U87细胞和对照细胞不同时期的细胞活力，分别绘制两组细胞增殖曲线。发现LINC00511沉默之后的U251细胞不同时期的活力均低于对照组(P＜0.01)，而LINC00511过表达的U87细胞不同时期的活力均高于对照组(P＜0.01)。说明LINC00511可激活胶质瘤细胞的增殖活力。 4.Transwell实验结果 通过Transwell实验检测LINC00511沉默后和过表达后与对照组相比的迁移数据，显示LINC00511沉默之后的U251细胞透膜的数量明显少于对照组，其侵袭能力显著降低(P＜0.01)，而LINC00511过表达的U87细胞透膜的数量明显多于对照组，其侵袭能力显著升高(P＜0.01)。由此判断，LINC00511可增强胶质瘤细胞的侵袭能力。 5.裸鼠成瘤实验结果 经多项体外实验验证后，我们将慢病毒稳定转染sh-LINC00511和空载体转染(对照组)后的U251细胞注射入BALB/C裸鼠(雄性，4-6周大)侧腹进行裸鼠成瘤实验，结果发现LINC00511沉默组的裸鼠肿瘤生长速度、肿瘤体积及肿瘤重量均小于对照组的裸鼠。表明LINC00511的沉默可抑制胶质瘤细胞的肿瘤生长。 小结： 1.LINC00511过表达后对胶质瘤细胞克隆形成有促进作用，而LINC00511沉默之后对胶质瘤细胞克隆形成有抑制作用。 2.LINC00511可激活胶质瘤细胞的增殖活力。 3.LINC00511可增强胶质瘤细胞的侵袭能力。 4.在体内，LINC00511的沉默可抑制胶质瘤细胞的肿瘤生长。 第三部分转录因子Sp1诱导加速了胶质瘤细胞中LINC00511的转录 目的：探讨LINC00511的上游调控靶点并验证其具体作用机制。 方法： 1.通过在线生物信息学工具(jaspar，)预测LINC00511的上游调控靶点，发现转录因子Sp1与LINC00511启动子具有潜在的结合位点，搜集相关文献确认研究对象。 2.应用染色质免疫沉淀(CHIP)分析确认Sp1与LINC00511启动子区的两个潜在结合位点的结合情况。 3.构建该启动子区域的荧光素酶报告载体，同时共转染该转录因子的过表达质粒，使用荧光素酶报告基因测定确认分子结合，验证LINC00511与Sp1的作用关系。 4.应用qRT-PCR技术检测U87细胞及U251细胞中Sp1mRNA表达水平与阴性对照组的对比变化。 5.应用Westernblot法检测Sp1重组质粒转染的胶质瘤细胞中Sp1蛋白表达水平的对比变化。 6.应用qRT-PCR技术检测Sp1重组质粒转染的胶质瘤细胞中LINC00511表达水平的对比变化。 7.基于TCGA数据库的大规模数据分析Sp1调高和降低后患者的生存周期，绘制生存曲线图示。 结果： 1.在对LINC00511上游调控的研究中，我们通过在线生物信息学工具(jaspar，)预测发现转录因子Sp1可以与LINC00511的启动子区结合。 2.LINC00511启动子区有两个潜在的结合位点(E1, E2)。染色质免疫沉淀(CHIP)分析显示，Sp1可以直接结合第一个位点(E1,-551~-541)。 3.荧光素酶报告检测结果表明，转染野生型TFBS(转录因子结合位点)的胶质瘤细胞与突变型相比具有显著的活性(P＜0.01)。 4.qRT-PCR技术检测U87细胞及U251细胞中Sp1mRNA表达水平，显示其在胶质瘤细胞(U87，U251)中较正常胶质细胞中明显上调。 5.Westernblot法和qRT-PCR技术分别检测Sp1重组质粒转染的U251细胞中Sp1蛋白表达水平和LINC00511的表达水平，显示增强的Sp1过表达质粒不仅能提高Sp1蛋白水平，而且能提高LINC00511RNA水平，提示Sp1可诱导增强LINC00511的表达水平。 6.基于TCGA数据库的生存分析表明，高水平的Sp1表明胶质瘤患者预后不良。 小结：数据证实转录因子Sp1诱导加速了胶质瘤细胞中LINC00511的转录。 第四部分LINC00511通过靶向调节miR-124-3p/CCND2轴加速胶质瘤的进展 目的：寻找LINC00511的下游作用靶点，进一步深入了解LINC00511对胶质瘤生物学影响的作用机制。 方法： 1.通过数据库lnclocator( tor/)预测LINC00511的亚细胞定位，并应用亚细胞定位实验进行验证。 2.应用数据库starbase3.0()在线预测表明miR-124-3p具有与LINC00511的3'-UTR区的互补结合位点。 3.构建该区域的荧光素酶报告载体，包括野生型和突变型，并将其导入U251细胞，使用荧光素酶报告基因测定确认分子结合，验证LINC00511与miR-124-3p的作用关系。 4.使用qRT-PCR技术检测miR-124-3p在U251和U87细胞中的表达水平。 5.在U251细胞中分别转染LINC00511siRNA和LINC00511plasmid，以沉默和过表达LINC00511，再通过qRT-PCR技术观察miR-124-3p的表达变化。 6.通过Starbase3.0预测表明，CCND2基因与miR-124-3p存在互补位点。 7.使用荧光素酶报告基因测定确认分子结合，验证miR-124-3p与CCND2的结合关系。 8.应用Westernblot分析显示由CCND2基因编码的cyclinD2蛋白在miR-124-3p抑制剂转染中的相对表达变化。 9.应用qRT-PCR分析显示转染LINC00511siRNA和转染LINC00511质粒后CCND2的mRNA表达水平变化。 10.基于TCGA的大宗数据验证CCND2水平在胶质瘤组织样本中的表达，并通过Spearman相关系数分析测量数据相关性，分析CCND2和LINC00511、Sp1和CCND2之间的关系。 结果： 1.数据库lnclocator和亚细胞定位实验表明LncRNALINC00511主要位于胶质瘤细胞的胞浆和胞质中，而非细胞核中。说明LINC00511并非在细胞核内通过与核内因子作用发挥调控作用，而主要是在胞浆中通过ceRNA机制发挥调控作用。 2.数据库starbase在线预测表明miR-124-3p具有与LINC005113'-UTR区的互补结合位点。 3.后续试验证实，首先，在U251和U87细胞中，miR-124-3p表达较对照组明显降低。其次，荧光素酶基因报告实验清楚地表明，荧光素酶载体被导入U251细胞后，荧光素酶活性降低，说明LINC00511可与miR-124-3p定位结合，下调其表达水平。在U251细胞中，LINC00511siRNA的转染使miR-124-3p表达升高，而LINC00511质粒的转染降低了miR-124-3p的表达，验证了LINC00511对miR-124-3p竞争性抑制的关系。 4.通过Starbase3.0预测表明，CCND2基因与miR-124-3p存在互补位点。 5.再次荧光素酶基因报告实验表明，荧光素酶载体CCND2野生型+mir-124-3p组被导入U251细胞后，荧光素酶活性降低。Westernblot分析显示，由CCND2基因编码的cyclinD2蛋白在miR-124-3p抑制剂转染中相对表达升高。qRT-PCR结果显示转染LINC00511siRNA后CCND2的mRNA表达水平随之降低，而转染LINC00511质粒则使其明显过度表达。基于TCGA的数据表明，CCND2水平在胶质瘤组织样本中明显过度表达，且通过Spearman相关系数分析测量相关性，表明CCND2和LINC00511、Sp1和CCND2之间存在正相关。 小结：以上数据表明，LINC00511通过与miR-124-3p竞争性海绵作用，调节增强CCND2的表达。
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