摘要
菵草是禾本科菵草属一年生杂草，喜湿，适生于水边及潮湿处，是我国长江中下游地区稻茬麦田的主要杂草之一。精噁唑禾草灵是防除菵草的主要除草剂品种之一，属于乙酰辅酶A羧化酶(Acetyle Coenzymy Carboxylase, ACCase)抑制剂类的除草剂，其作用靶标为禾本科杂草质体ACCase的CT亚基。2012年本课题组在江苏省丹阳市采集了疑似对精噁唑禾草灵产生抗性的种群JS-26，克隆其质体ACCase基因CT亚基编码序列测序比对后发现所有抗性植株都存在W1999L突变。目前该突变对ACCase抑制剂类除草剂的交互抗性模式以及分子机理尚未明确。本文采用dCAPS方法从JS-26种群获得基因背景一致的ACCase1999位野生型菵草(1999SS)和纯合突变型菵草(1999RR)；通过整株法生测确定菵草ACCaseW1999L突变对ACCase抑制剂类除草剂不同品种的交互抗性模式；通过同源模建-分子对接研究菵草ACCaseW1999L突变对ACCase抑制剂类除草剂与CT亚基结合的影响，确认其交互抗性模式的分子机理，为抗性菵草合理的化学防治提供理论基础和依据，主要研究结果如下： 1.采用整株法测定了JS-26种群对精噁唑禾草灵的抗性水平，结果表明JS-26种群对精噁唑禾草灵的抗性指数为565，对其产生了高水平抗性。随机选取25株菵草克隆其CT亚基编码基因，经测序比对发现，22株抗性植株中ACCase1999位氨基酸均含有亮氨酸(Leu)其中16株密码子为TGG/TGG，编码亮氨酸/亮氨酸(Leu/Leu)，6株为TTG/TGG，编码色氨酸/亮氨酸(Trp/Leu)；3敏感植株中ACCase1999位氨基酸密码子均为TTG，编码色氨酸(Trp)。 2.采用dCAPS方法从JS-26种群获得基因背景一致的ACCase1999位野生型菵草和纯合突变型菵草。通过错配引物克隆1999位附近编码基因序列并引入一个HindIII酶切位点，扩增产物经HindIII酶切后，突变纯合体在390bp处有单一条带，野生型在349bp处有单一条带，而杂合体在390bp和349bp处均有条带。应用此方法从所供试的96株菵草中获得79株抗性纯合体，1株杂合体，16株野生型，其抗性基因频率约为83%，收集纯合抗性以及野生型植株的种子，用于后续抗性水平的测定。 3.通过整株法测定抗性植株和野生型植株对ACCase抑制剂类除草剂不同品种的抗性水平。剂量-反应实验结果表明Trp1999Leu突变赋予精噁唑禾草灵中等水平抗性(8.20倍)，对精喹禾灵(20.29倍)、噁唑酰草胺(12.22倍)有高水平抗性，对炔草酯没有抗性(1.42倍)，对氰氟草酯有低水平抗性(2.73倍)；赋予对烯禾啶的中等水平抗性(6.38倍)，烯草酮没有抗性(1.59倍)；对唑啉草酯有高水平抗性(18.60倍)。 4.使用乙酰辅酶A羧化酶试剂盒测定了Trp1999Leu突变ACCase对精噁唑禾草灵的敏感性。结果表明，野生型ACCase(1999Trp/Trp)对精噁唑禾草灵的I50为64.318μM，突变型146.199μM，其抗性倍数为2.27倍，说明Trp1999Leu突变导致ACCase对精噁唑禾草灵的敏感性降低。 5.通过计算化学的方法合理的模建了ACCase类除草剂靶酶结构。以IUYS为模板，采用moe2015，amber力场，同源模建了10个模型，以打分最高的模型作为模建结果，并将该结果能量最小化后，得到模型最终的构象进行下一步的分子对接研究。 6.分子对接。分别将6种模型分子(精噁唑禾草灵、精喹禾灵、、炔草酯、烯草酮、烯禾啶和唑啉草酯)对接至野生型和突变型菵草ACCase的CT结合域，对接实验采用半柔性对接方式，选取最合适的复合物体系进行识别反应模式分析。以精噁唑禾草灵结合模式为例。对接结果表明，在结合精噁唑禾草灵野生型CT域的晶体结构中，靶酶结构的B/ALA150的NH、C=O分别与精噁唑禾草灵的C=O、-OH形成氢键，键长为2.02?、1.95?，精噁唑禾草灵的苯并噁唑环的苯环与靶酶B/TYR257形成π-π作用，靶酶结构的B/THR276、B/GLY253、B/TYR257形成疏水口袋；而在结合精噁唑禾草灵突变型CT域的晶体结构中，精噁唑禾草灵的C=O、-OH与B/ALA150的NH、C=O形成氢键，其键长分别为2.04?、1.97?，苯并噁唑环的苯环与靶酶B/TYR257形成π-π作用，靶酶的B/ASN223、B/THR276、B/GLY253、C/GLY515以及B/SER227形成疏水口袋。突变后氢键键长增加，疏水口袋变大，使精噁唑禾草灵分子与靶酶的结合力减弱，对接结果与生测结果相吻合。 由6种ACCase类除草剂与CT域晶体结构突变前后的结合模式的异同，可以看出，ACCase类除草剂在与靶酶结构突变前后结合时，虽然结合构象并未发生较明显的变化，但一些重要氢键相互作用的键长增加，导致APP类除草剂分子与靶酶结合能力有明显减弱。 本文明确了菵草ACCaseW1999L突变对ACCase抑制剂类除草剂交互抗性模式，初步探索了其分子机理，可为科学合理防治抗性菵草提供了理论依据。
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