摘要
磷元素是植物细胞重要的组成和必需元素，在细胞分裂、物质和能量代谢、信号传导、基因表达等调控中发挥着重要作用。研究表明，大豆根瘤固氮时期根瘤对磷素的需求量远远高于植物自身生长发育及氮素同化所需磷量，低磷胁迫影响根瘤的生长发育、固氮酶活性、干物质积累，降低大豆产量和品质。鉴于此，本研究对大豆幼苗接种根瘤菌的同时进行正常磷和低磷处理，选取结瘤固氮相关性状具有显著差异的28d根瘤进行高通量转录组测序，筛选结瘤固氮相关基因，并研究其固氮功能和作用机制，为高固氮大豆新品种的分子育种提供基因资源，为探索低磷胁迫影响大豆根瘤生长发育和生物固氮的分子机理奠定基础。主要研究结果如下: 1.明确了磷处理28d的大豆结瘤固氮相关性状在不同磷处理间存在显著差异。低磷处理28d的大豆与正常磷处理相比植株矮小、基部叶片发黄，植株总鲜重和干重显著降低，根冠比增加;根瘤数目和大小分别降低25.2％和52.2％，根瘤固氮酶活性显著降低66％;大豆植株及其地上部、根、根瘤的含氮量分别降低56.1％、71.4％、82.5％、16.7％，大豆植株及其地上部、根及根瘤的磷含量分别减少55.5％、71.1％、81.9％、16.7％。 2.转录组测序数据分析发掘了参与大豆根瘤发育的重要基因。两种磷处理28d的根瘤转录组测序共获得419个差异表达基因，显著上调基因171个，主要参与根瘤生长发育、植物激素信号传导和氨基酸代谢等;显著下调基因248个，除了参与代谢过程之外，主要参与次生代谢物的合成，植物-病原菌的互作，淀粉和糖类的代谢等。 3.证实紫色酸性磷酸酶GmPAP12低磷条件下可促进大豆根瘤发育和生物固氮。研究发现GmPAP12基因的启动子受低磷诱导后GUS活性明显提高，GmPAP12基因在根瘤中过表达后，低磷胁迫下，根瘤个数和鲜重和固氮酶活性显著高于野生型;GmPAP12基因在根瘤中被干扰后根瘤总个数、根瘤总鲜重及固氮酶活性较野生型明显降低，表明低磷下GmPAP12促进了根瘤的生长，在生物固氮过程中具有重要作用。 4.发现P1BS是候选基因GmPAP12启动子作用元件。P1BS作用元件是转录因子GmPHR1的结合位点，酵母单杂交试验进一步证明了GmPHR1对GmPAP12启动子P1BS作用元件的结合，分析419个差异显著基因发现有大约50％的基因启动子中含有P1BS作用元件，说明在根瘤中转录因子GmPHR1在低磷胁迫中起着重要作用。 5.验证了转录因子GmPHR1在大豆根瘤发育中的生物学功能和作用机制。GmPHR1与调控元件P1BS结合，调控候选基因GmPAP12等下游基因的表达。低磷胁迫下，GmPHR1基因过表达植株的根瘤总个数、鲜重和固氮酶活性显著高于野生型;GmPHR1基因被干扰后根瘤总个数、鲜重及固氮酶活性较野生型明显降低，这些结果表明GmPHR1参与根瘤的磷平衡，在根瘤生长发育和生物固氮过程中起重要作用。 基于以上结果，本课题得出以下结论:磷元素是大豆根瘤生长发育和生物固氮必需元素，磷元素的缺乏将严重影响根瘤生长发育及功能;28d根瘤高通量转录组测序表明，低磷胁迫和正常磷相比，419个基因表达有差异显著，这些基因主要参与代谢、植物激素信号传导、氨基酸代谢、淀粉和糖类的代谢和植物-病原菌的互作等生物学过程;419个差异基因中有50％的基因的启动子中含有P1BS序列，说明这些基因的表达量受转录因子GmPHR1调控，GmPHR1基因在大豆根瘤中的超表达和干涉研究，进一步说明在根瘤中GmPHR1在调控磷平衡中起着重要作用。
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