中华散尾鬼笔活性物质的提取优化及作用机制研究

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中文摘要：当今植物病虫害的防治仍然侧重于使用化学农药，随着单一农药品种使用时间的增长，林木害虫和病原菌都产生了一定的耐药性，这致使杀虫剂、杀菌剂的用量在近年来逐渐增大，大量使用化学农药已给人类社会造成非常严重环境污染与经济损失。在国家的倡导下，生物农药的使用比例逐年增加，寻求高效、安全、无污染的绿色新型生物农药显得尤为迫切。真菌中含有大量抗虫、抗菌、抗病毒等活性物质。本论文在前期试验中证明，中华散尾鬼笔具有抑菌活性，显示出中华散尾鬼笔在生物防治领域具有应用开发的潜力，作为生物源农药资源具有重要开发前景。本研究通过野外采集中华散尾鬼笔，采用不同提取方式提取杀虫抑菌活性物质，并进行提取条件优化，分离纯化中华散尾鬼笔粗取物，并对森林害虫和病原菌进行生物测定，研究了粗提取对害虫和病原菌酶活的影响及作用机制，获得如下研究成果: (1)用乙醇对中华散尾鬼笔的子实体进行活性物质提取，利用Plackett-Burman和Box-Behnken试验设计方法，对影响中华散尾鬼笔乙醇提取物的5个因素进行筛选，对关键因素进行优化，结果确定中华散尾鬼笔乙醇提取物的最佳工艺条件为:乙醇浓度60％、料液比1∶80(g/mL)、超声时间80min，在此条件下中华散尾鬼笔杀虫物质的提取率为31.21％，与提取率的理论值31.36％相近。 (2)应用扫描电子显微镜观察超声辅助提取与浸提法，对中华散尾鬼笔物料表面的不同影响。结果表明，对中华散尾鬼笔粉末进行超声辅助提取，提取率为31.23％，使用温水浸提的方法为24.10％;并且由温水浸提提取的表面组织是波浪状和光滑的，与其相比，超声处理的中华散尾鬼笔样品的表面形态松散、粗糙。 (3)利用GC-MC分析中华散尾鬼笔乙醇提取物中的化学成分，得出样品中存在戊酸(Pentanoic acid)、十六烷酸，乙基酯(Pentanoic acid Hexadecanoic acid，ethyl ester)等7种化合物。 (4)测定中华散尾鬼笔抑菌活性物质主要存在于发酵液中，之后对发酵液中的活性物质进行萃取及萃取条件优化。结果显示，中华散尾鬼笔的活性物质存在于发酵液中，发酵液中活性物质最佳的提取溶剂为正丁醇，最佳料液比为1∶3，最佳提取次数为3次。 (5)应用硅胶柱层析等分离纯化技术，并用薄层层析跟踪检测，对中华散尾鬼笔正丁醇提取物进行分离纯化。得到中华散尾鬼笔抑菌提取物L134。 (6)通过研究中华散尾鬼笔抑菌物质L134对拟盘多毛孢孢子萌发、菌丝的生长过程、膜透性、细胞壁完整性和关键酶系的影响，初步阐明了提取物L134对拟盘多毛孢的生物防治机理。提取物L134能够抑制拟盘多毛孢孢子萌发，并且对菌丝生长有抑制作用EC50为0.305mg/mL;影响拟盘多毛孢菌丝体SOD、POD、PPO、CAT、CL的活性，导致致病力下降，氧自由基清除系统出现障碍，MDA含量升高，膜质过氧化加重;L134能对拟盘多毛孢菌丝的细胞壁产生不良影响，同时对其菌丝生长的外部形态也产生了负面作用。 (7)对中华散尾鬼笔提取物L134的稳定性测定的结果表明:提取物L134在不同pH值处理下比较稳定;处理温度在65℃以下比较稳定;应用不同金属离子处理中华散尾鬼笔提取物L134，其抑菌活性无显著差异;在氧化剂和还原剂处理的中华散尾鬼笔提取物L134的试验中，氧化剂会影响中华散尾鬼笔的抑菌活性物质的稳定性，但在紫外线照射下稳定性良好。 (8)最后为了验证试验结果，分别测试不同提取物对舞毒蛾和多种病原菌的生物活性。结果表明:中华散尾鬼笔乙醇提取物对舞毒蛾幼虫有良好的杀虫活性，死亡率达到59.77％;中华散尾鬼笔正丁醇提取物对樟子松枯梢病（Sphaeropsis visci樟子松黑点针枯病（Pestalotiopsis sp.）、杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）等真菌均具有抑制活性。

作者：

林连男

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关键词：

森林害虫中华散尾鬼笔活性物质提取优化抑菌活性

授予学位：

博士

学科专业：

森林保护学

导师：

张国财

学位年度：

2019

学位授予单位：

东北林业大学

语种：

中文

中图分类号：