摘要
中华大蟾蜍(Bufo Gargarizans )属于脊索动物门(Chordata )、脊椎动物亚门(Vertebrata)、两栖纲(Amphibia)、无尾目(Anura)、蟾蜍科(Bufonidae)、蟾蜍属(Bufo)动物，是珍贵的药用动物。生物活性肽因为其具有对生命机体功能发挥着重要的作用，因而在世界范围内成为探索的热点之一。本研究是以中华大蟾蜍为研究对象，主要对蟾蜍皮应用酶解法制备活性肽并进行抗氧化和抗菌方面的药理研究。本论文研究内容主要如下： 1、蟾蜍皮酶解条件优化及理化性质研究：对中华大蟾蜍使用酶解法提取活性肽，优化酶解条件，并对通过酶解法提取到的活性肽进行理化性质的研究。试验结果表明酶解法能够从蟾皮中获得活性肽，酶解产物命名为W1。通过比较碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶与中性蛋白酶五种蛋白酶对蟾蜍皮的水解度确定最佳水解酶是中性蛋白酶。使用中性蛋白酶进行时间、底物浓度和E/S单因素和正交试验，得出最佳酶解工艺条件为水解时间4h，底物浓度6%，E/S为15%。粗提物W1经Tricine-SDS-PAGE测定，结果显示蟾蜍皮肤活性肽粗提物分子量集中在10KDa以下。 2、蟾蜍皮酶解肽分离及抗氧化性研究：试验采用Sephadex—G50凝胶过滤色谱法对蟾蜍皮活性肽粗提物W1进行分离纯化，对分离得到的组分进行抗氧化试验以及氨基酸成分研究。分离结果得到F1、F2两种组分。比较两种组分对DPPH?、ABTS+?、?OH的清除作用和还原力强弱。经比较发现各种方法测定的抗氧化结果F2均高于F1，其中F1、F2对DPPH?最大清除率都接近100%，IC50分别为2.24mg/mL与1.004mg/mL；F1、F2对ABTS+?最大清除率也都接近100%，IC50分别为1.94mg/mL与1.13mg/mL；F1、F2对?OH最大清除率都达到了80%以上，IC50分别为0.73mg/mL与0.63mg/mL；其还原力测定结果证实了F1与F2都有很强的抗氧化性，并且F2的还原力高于F1。氨基酸分析结果表明F1和F2各有17种氨基酸，其中F1和F2含有的疏水性氨基酸有丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸以及异亮氨酸；F2中含有的疏水性氨基酸浓度均高于F1中对应的氨基酸；从必需氨基酸角度看，F1与F2中含有亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸，并且除了蛋氨酸外，其他几种必需氨基酸浓度F2均明显高于F1对应的必需氨基酸。 3、蟾蜍皮酶解肽抗菌性研究：试验采用金黄色葡萄球菌与大肠杆菌分别作为革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的代表菌种，以卡那霉素作为阳性对照，无菌水作为阴性对照，测定F1、F2两种组分的抑菌性研究。结果表明F2对金黄色葡萄球菌抑制效果较强，对大肠杆菌抑菌作用相对较弱，而F1对金黄色葡萄球菌的抑菌作用远不及F2，对大肠杆菌并未发现抑制作用；对F2进行两种菌的最低抑菌浓度测定，结果发现F2对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为15.63μg/mL，对大肠杆菌的最低抑菌浓度为250μg/mL，相对较高。
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