摘要
背景 病理性瘢痕是以组织纤维化异常增殖和慢性炎症为主要表现的皮肤纤维增生性疾病，其发病机制尚未完全清楚，目前暂无理想治疗方法。因此，阐明病理性瘢痕的发病机制，针对其发病发展机制的特异性靶点研究，成为开发治疗病理性瘢痕新药的新方向。肿瘤坏死因子α刺激因子6(tumornecrosisfactorαstimulatedgene6，TSG-6)被认为是一种参与多种炎性反应的基因，可抑制炎症因子如白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)等的表达，抑制中性粒细胞浸润及减少炎性损伤。研究发现，瘢痕疙瘩中TSG-6表达水平较无瘢痕修复皮肤明显减少。本课题组在前期体内体外实验中发现，TSG-6可抑制兔耳增生性瘢痕的炎症反应，减轻炎症程度。已有研究表明，TSG-6高表达瘢痕疙瘩组织中，转化生长因子-β1((Transforminggrowthfactorbeta-1,TGF-β1)表达下降。因此，我们推测其抑制病理性瘢痕的机制，可能与TGF-β1介导的通路有关。TGF-β1被认为是病理性瘢痕最关键的致病因子，其介导的TGF-β1/smads信号通路通过影响成纤维细胞的形成、抑制胶原等细胞外基质蛋白的降解和促进血管生成三种形式形成。其通过结合细胞膜上的TGF-βI型和II型受体使细胞内Smad2、Smad3磷酸化，活化的Smad2/Smad3复合体与Smad4结合进入细胞核后，调控不同基因表达进而影响成纤维细胞增殖或凋亡、胶原蛋白的合成或降解。本课题拟继续进一步研究TSG-6对瘢痕疙瘩成纤维细胞内TGF-β1/smad信号通路的影响，进一步阐明其抗瘢痕疙瘩的作用。 方法 1.瘢痕疙瘩成纤维细胞(human keloid fibroblast，HKFs)培养及传代 采用IV型胶原酶对瘢痕疙瘩样本进行消化后，分离提取，纯化培养HKF，培养基选用Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium , DMEM)，内添加链霉素、L-谷氨酰胺、胎牛血清，一般培养至5-6代细胞用于实验及慢病毒转载。 2.TSG-6对瘢痕疙瘩成纤维细胞活性影响的初步判定 细胞分为两组，TSG-6处理组、对照组，TSG-6组中加入重组人TSG-6蛋白。 (1)流式细胞分析测定细胞周期：取两组细胞，采用PI染色，观察单位面积内不同时间段细胞的数量 (2)TUNEL法检测细胞凋亡：采用TUNEL法，在光学显微镜下观察，对单元格内TUNEL染色阳性(褐色)细胞进行计数。 (3)免疫组化法检测TSG-6对增殖性抗原(PCNA)表达的细胞数目的影响 3.慢病毒载体建设和包装 设计引物合成，构建干扰效率高且稳定的TSG-6的siRNA，对重组慢病毒表达载体(Plvx-pour-TSG-6)及重组慢病毒干扰载体(Plvx-shRNA1-TSG-6)进行构建，采用293T细胞对慢病毒进行包装，以Lenti-Xp24RapidTiterKit试剂盒检测慢病毒滴度，滴度大于106PFU/mL时即可收获上清，去除细胞碎片后-80℃保存。 4.重组慢病毒感染与筛查 将细胞浓度调制5×107cells/L后，将细胞接种至6孔培养皿中，培养第二天，将各种病毒分别加入6孔培养皿中，并加入浓度为8mg/l的嘌呤霉素。采用上述方法五天后行细胞重测，48小时后，用含有2.5mg/l的嘌呤霉素培养基进行细胞筛选。经过连续1周筛选后，在正常培养基中产生TSG-6过表达HKF组、TSG-6干扰HKF组及相应对照组。 5.TSG-6在各组转染HKFs中表达的检测 分别收集五组细胞，包括HKFs组，TSG-6过表达HKFs组、TSG-6干扰HKFs组、过表达对照组和干扰对照组。提取细胞总RNA，合成cDNA。采用SYBRGreen法进行荧光定量PCR。检测TSG-6mRNA在各组细胞中的表达。采用WesternBlot(WB)法检测TSG-6蛋白在过表达细胞组中的表达 6.MTT法和流式细胞术检测感染后细胞不同时间增殖与凋亡 采用MTT法检测五组细胞的增殖情况，采用流式细胞分析技术检测转染TSG-6过表达HKF组、TSG-6干扰HKF组和HKF组细胞的凋亡和细胞周期阻滞。7.TSG-6对TGF--β1/Smads信号通路的影响 (1)免疫沉淀和免疫印迹分析 细胞共分为六组：溶媒对照组、HKF-TGF-β1group,TSG-6过表达HKF-TGF-β1组、TSG-6过表达HKF-TGF-β1对照组、TSG-6干扰HKF-TGF-β1对照组、TSG-6干扰HKF-TGF-β1组。除溶媒对照组外，其余每组细胞分别加入40pMTGF-β1。培养后提取细胞总蛋白，用小鼠抗smad2/3抗体进行免疫沉淀，通过免疫沉淀及免疫印迹分析检测Smad2/3在c端磷酸化情况。免疫沉淀后，加入小鼠anti-Smad4，使用WB法检测Smad2/3/4复合物的表达。同样六组细胞，除溶媒组外，在TGF-β1刺激下，经过培养，加入相应抗体后，使用WB法，检测Smad7和纤溶酶原激活物抑制剂-1(Plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1)蛋白表达情况。 (2)免疫荧光分析 细胞分组同上述实验，除溶媒对照组外，加入TGF-β1刺激后，经过固定、共孵育等步骤，在荧光显微镜下拍摄smad2/3染色细胞区域。 (3)RT-PCR分析六组细胞中PAI-1mRNA水平 同样六组细胞，除溶媒组外，在TGF-β1刺激后，提取总RNA，行RT-PCR分析，检测六组细胞中PAI-1mRNA表达水平。 结果 1.观察各组形态及TSG-6对HKFs活性影响的初步判定 1.1细胞形态最初接种的细胞为圆形球状细胞团簇，倒置显微镜下，附着细胞变为较长的梭形或三角形。 1.2TSG-6促进细胞凋亡TUNEL法检测结果提示TSG-6处理组较对照组，TUNEL染色的细胞密度更高。PCNA阳性的细胞数，TSG-6处理组低于对照组。 1.3TSG-6影响细胞周期流式细胞术PI染色提示TSG-6处理组细胞在G1期被阻断。 2.TSG-6表达及干扰慢病毒载体转染HKFs后各组TSG-6mRNA表达的不同 2.1转染率检测PCR产物琼脂糖浆电泳得到828bp的靶基因片段，其大小符合TSG-6。琼脂糖凝胶电泳显示感染后阳性克隆，阳性和阴性转化株的条带大小分别为1179bp和198bp，经BLAST检测，克隆序列鉴定结果为828/828(100%)，成功构建了靶基因慢病毒载体。 2.2TSG-6在感染后的表达RT-PCR显示TSG-6过表达HKF组同HKF组、PLVX–Puro(表达载体)组相比，TSG-6mRNA表达水平较高，而HKF组同Plvx-Puro组相比，TSG-6mRNA表达无明显差异。 3.TSG-6表达及干扰慢病毒载体转染HKFs后TSG-6对细胞增殖与凋亡的影响 3.1TSG-6过表达抑制HKFs增殖采用MTT法检测结果提示与空白质粒和PLVX-Puro组相比，转染TSG-6过表达组(PLVX-Puro-TSG-6)中HKFs的增殖明显下降。同时，转染TSG-6干扰(PLVX-shRNA1-TSG-6)组与空白质粒和干扰载体(PLVX-shRNA1)组相比，HKFs的增殖明显增加。 3.2TSG-6过表达诱导HKFs凋亡TSG-6过表达组细胞凋亡率为51.92%，明显高于PlVX-Puro组(19.00%)和HKFs组(3.59%；P＜0.05)。 3.3TSG-6调控细胞周期流式细胞术分析提示细胞在G2/M期被TSG-6过表达所抑制 4.TSG-6抑制HKFs的TGF--β1/Smad信号通路途径 4.1TSG-6抑制Smad2/3C端磷酸化，抑制Smad2/3/4复合物表达与HKF-TGF-β1组和TSG-6过表达HKF-TGF-β1对照组相比，TSG-6过表达HKF-TGF-β1组Smad2/3/4复合物表达水平明显降低。相反，TSG-6干扰HKF-TGF-β1组，Smad2/3/4复合物表达水平升高。 4.2TSG-6抑制磷酸化Smad2/3转位入核与HKF-TGF-β组和TSG-6过表达HKF-TGF-β1对照组相比，在TGF-β1的刺激后，TSG-6过表达HKF-TGF-β1组的pSmad2C和pSmad3C荧光强度减弱，提示其抑制核内转位。 4.3TSG-6影响成纤维细胞中Smad7和PAI-1表达在TGF-β1刺激后，TSG-6过表达组中Smad7蛋白表达高于其余各组，提示TSG-6可上调Smad7表达。RT-PCR结果提示PAI-1在TSG-6过表达组中明显减少，而干扰组中明显增加。 结论 TSG-6抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、促进凋亡，干扰其细胞周期。根据上述研究提示，TSG-6对瘢痕疙瘩成纤维细胞的抑制作用的机制，可能涉及TGF--β1/Smad信号通路途径，其可抑制该信号通路Smad2、Smad3磷酸化，Smad2/3/4复合体形成及Smad2/3转位入核，同时上调负调控蛋白Smad7表达，抑制PAI-1mRNA表达，这些结果为TSG-6在预防病理性瘢痕形成中的潜在治疗应用提供了依据。
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