摘要
牛病毒性腹泻-黏膜病(Bovine viral diarrhea, BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)感染引起的病毒性传染病，主要感染牛，表现为呼吸系统、消化系统疾病和致死性黏膜病，对世界养牛业造成极大的危害，引起国内外学者对于BVDV致病机制研究的重视。研究表明BVDV非结构蛋白(Non-structrual protein)4B在病毒复制过程中发挥重要作用，此外NS4B还具有RNA结合活性和NTP酶活性，能够诱导膜复制，参与病毒感染细胞膜的重排过程。 本研究采用酵母双杂交方法，筛选出与BVDVNS4B蛋白相互作用的宿主蛋白。PCR扩增BVDVNS4B基因，将其与pGBKT7载体连接，构建诱饵质粒pGBKT7-NS4B并转入Y2HGold酵母感受态细胞，经验证pGBKT7-NS4B诱饵质粒无自激活活性和毒性，诱饵质粒可用于后续酵母双杂交实验。 提取牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney cells, MDBK)RNA，经LD-PCR得到dscDNA，将其与pGADT7-Rec载体连接构建牛肾细胞cDNA文库，文库库容约为3.4×106cfu/mL，均一化程度良好，可用于酵母双杂交筛选。 将pGBKT7-NS4B诱饵质粒与MDBKcDNA文库进行双杂交，初筛得到LYZ1、PSMC4、Bak1、MKRN1、TP53BP2和CKM等6种与NS4B蛋白有相互作用的宿主蛋白。从初筛蛋白中选择Bak1蛋白构建pGADT7-Rec-Bak1猎物质粒与NS4B诱饵质粒进行点对点杂交鉴定；构建pGBKT7-Bak1诱饵质粒及pGADT7-Rec-NS4B猎物质粒进行反交鉴定，鉴定结果均为阳性，证明Bak1蛋白与BVDVNS4B蛋白存在互作。 从宿主细胞文库中筛选到与BVDVNS4B蛋白互作的宿主蛋白Bak1，为细胞凋亡正调节因子，表明NS4B蛋白可能参与BVDV感染细胞后诱导凋亡的过程。这为进一步阐明BVDV在宿主细胞内感染的分子机制奠定基础。
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