摘要
研究背景：微生物感染是孕妇常见疾病，严重患者可导致孕妇并发症和有害胎儿出生结局。微生物感染引起的发育毒性已经受到了广泛的关注，课题组使用细菌脂多糖(LPS)成功建立了小鼠孕期感染模型，系列研究结果发现孕期LPS暴露引起流产、胚胎和胎儿死亡、畸形、宫内生长受限、早产、出生后神经发育受损和代谢异常。过去的研究更多的关注LPS对子代的发育毒性及其机制，但对母体的损害效应关注较少。胆汁酸代谢紊乱是妊娠期常见的疾病，不仅可以导致子代不良妊娠结局，还诱发孕妇死亡和妊娠并发症，增加孕妇产后肝脏疾病和代谢改变的发病风险。已有研究发现LPS可以干扰成年小鼠胆汁酸的代谢过程，提示孕期LPS可能诱发胆汁酸代谢紊乱。胆汁酸按化学结构可分为游离胆汁酸和结合胆汁酸两类，不同的胆汁酸成分由于疏水性和亲水性不同对组织和细胞的毒性存在较大差异。因而，确定孕期LPS对孕期胆汁酸谱的影响具有重要的意义。胆汁酸可以作为信号分子激活法尼醇X受体(FXR)参与对糖、脂、氨基酸、能量、内分泌和炎症的调控，引起了越来越广泛的关注。胆汁酸受体FXR在调控胆汁酸合成、转运和分解过程中发挥重要调节作用。肝脏细胞紧密连接也在胆汁酸紊乱形成过程中发挥重要作用。机体内的胆汁酸稳态还受生物节律调控，生物节律紊乱能诱发胆汁淤积，而炎症也能干扰肝脏生物节律基因表达和肝脏代谢稳态。此外，LPS能诱发肝脏内质网应激反应，而内质网应激可通过下调胆汁酸合成酶Cyp7a1抑制胆汁酸合成，内质网应激感受器需肌醇酶1α(IRE1α)可通过自身磷酸化激活其核酸内切酶活性剪切含有特异性碱基序列的mRNA和miRNA，在代谢和肝脏疾病中发挥作用。研究还发现FXR激动剂奥贝胆酸(OCA)通过激活IRE1信号减轻肝损伤。因此，FXR在孕期LPS诱发胆汁酸代谢紊乱过程中的作用机理需要深入研究，肝脏生物节律基因是否参与FXR对LPS诱发胆汁酸代谢紊乱的调控过程，以及IRE1α核酸内切酶在FXR影响LPS诱发胆汁酸代谢紊乱中的作用也需要被进一步研究。 目的：本课题拟通过观察急性LPS暴露对孕期母体胆汁酸谱的影响，确定LPS对母体胆汁酸代谢的干扰作用，通过观察FXR激动剂OCA对LPS诱发母体胆汁酸代谢紊乱的影响，确定OCA对LPS诱发胆汁酸代谢紊乱的保护作用；探讨OCA激活FXR信号在孕期LPS诱发胆汁酸代谢紊乱过程中的作用机理；初步探讨肝脏生物节律基因与OCA保护LPS诱发胆汁酸代谢紊乱之间的关联；通过分析OCA对LPS激活母鼠肝脏组织IRE1信号的影响，结合体外实验观察IRE1α核酸内切酶选择性抑制对内质网应激诱导剂下调肝细胞胆汁酸合成关键酶Cyp7a1的影响，初步探讨IRE1α核酸内切酶在OCA保护LPS诱发胆汁酸紊乱中的作用。 方法：本研究包括动物实验和体外实验。动物实验：为观察急性LPS暴露对孕期母体胆汁酸谱的影响，将受孕ICR小鼠随机分成对照组和LPS暴露组。在GD17上午9:00AM经腹腔注射给予LPS暴露组孕鼠200μg/kgLPS单次处理，对照组孕鼠给予等容积的生理盐水。为观察FXR激动剂OCA在LPS诱发孕期胆汁酸代谢紊乱中的作用，将受孕ICR小鼠随机分成6组。LPS0h、1h和6h暴露组孕鼠在GD17分别经腹腔注射给予单剂量LPS(200μg/kg)处理，OCA干预组孕鼠在GD15-17每日早晨8:00AM经灌胃给予OCA(5 mg/kg)预处理，再给予单剂量LPS处理。所有小鼠均在GD17上午9:00AM开始禁食，6h后于15:00PM处死，收集母鼠血液和肝脏组织。体外实验：(1)为验证OCA对LPS抑制FXR信号的激活作用，将AML12细胞共分为6组，LPS0h处理组、LPS1h处理组、LPS6h处理组、OCA+LPS0h处理组、OCA+LPS1h处理组和OCA+LPS6h处理组，用2μg/mlLPS处理AML12肝细胞，用10μMOCA在LPS处理前1h预处理AML12肝细胞。所有AML12肝细胞均在同一时间收集。(2)为研究IRE1α核酸内切酶对胆汁酸合成限速酶Cyp7a1的影响，使用内质网应激诱导剂衣霉素(TM)激活IRE1α核酸内切酶，用IRE1α核酸内切酶特异性抑制剂STF-083010(STF)预处理抑制IRE1α核酸内切酶的激活，观察对Cyp7a1mRNA的影响。AML12肝细胞处理共分为4组：对照组、单纯STF预处理组、TM处理组和STF+TM共处理组。用1.5μg/mlTM处理AML12肝细胞，用60μMSTF在LPS处理AML12肝细胞前1h进行预处理，所有AML12肝细胞均在LPS处理后6h同一时间进行收集。用全自动生化分析仪以生化比色法分别测定血清总胆汁酸(TBA)；用LC-MS/MS检测母鼠血清和肝脏组织胆汁酸谱；用蛋白质免疫印迹技术检测FXR核蛋白水平、CYP7A1和CYP3A总蛋白水平，以及总蛋白pIRE1α/IRE1α水平，用实时定量PCR技术检测母鼠肝脏组织Fxr、Shp、Cyp7a1、Cyp8b1、Cyp3a11、Bsep、Bcrp、Ntcp、Mrp2、Mrp3、Mdr1a、Mdr1b、Mdr3、Bmal1、Clock、Cry1、Cry2、Per1、Per2、Rev-erbα、Rorα、Dbp、Tjp1、Tjp2、E-cadherin、Occludin和Xbp-1s等基因mRNA水平。 结果：(1)本课题通过观察急性LPS孕晚期处理ICR小鼠对母体胆汁酸代谢和胆汁酸谱的影响，发现孕晚期母鼠LPS暴露能诱发胆汁酸代谢紊乱，明显升高母鼠血清CA、TCA、DCA、CDCA、GCA、TCDCA、TUDCA和GCA以及肝脏组织DCA和CA等胆汁酸成分的含量，改变了母鼠血清和肝脏组织胆汁酸谱。(2)本课题通过观察FXR激动剂OCA预处理对LPS孕诱发母体胆汁酸代谢紊乱的影响，发现OCA预处理明显降低母鼠血清CA、TCA、DCA、TCDCA、CDCA、GCA和TDCA以及肝脏组织DCA、TCA、TDCA、TUDCA、CDCA和TCDCA等胆汁酸成分的含量，保护LPS诱发胆汁酸代谢紊乱。(3)本课题通过观察FXR激动剂OCA对急性LPS孕晚期处理ICR小鼠对母体肝脏组织胆汁酸代谢过程的影响，发现孕晚期母鼠LPS暴露下调胆汁酸分解酶CYP3A1和胆汁酸合成限速酶CYP7A1和CYP8B1，明显降低母鼠肝脏组织Bsep、Ntcp、Mrp2、Mrp3、Mdr1a和Mdr3等转运体和Tjp1、E-cadherin和Occludin等紧密连接结构关键基因的mRNA水平；OCA预处理能明显下调CYP7A1，并上调CYP3A和转运体Mdr1a、Mdr1bmRNA水平，表明孕期LPS暴露通过下调胆汁酸合成、转运、代谢和紧密连接关键基因诱发胆汁酸代谢紊乱，OCA可以通过激活FXR降低胆汁酸合成、增加胆汁酸分解和增强胆汁酸转运对LPS诱发胆汁酸代谢紊乱起保护作用。(4)本课题通过观察FXR激动剂OCA对LPS处理孕晚期ICR小鼠对母体肝脏生物节律基因的影响，发现LPS明显升高母鼠肝脏生物节律正调控因子Bmal1的mRNA水平，降低生物节律负调控因子白蛋白D位点结合蛋白(Dbp)、Per2和Rev-erbα的mRNA水平，以负调控因子DBP的降低最显著，并呈现明显的时间-效应关系，OCA预处理进一步明显升高母鼠肝脏Bmal1的mRNA水平，也进一步明显降低Dbp、Per1和Per2的mRNA水平，也以DBPmRNA水平的降低最显著，表明LPS干扰孕晚期母体胆汁酸代谢，以及OCA保护LPS暴露对胆汁酸代谢的干扰作用，均与受生物节律调控的基因DBP相关。(5)本研究通过分析FXR激活对LPS暴露激活母鼠肝脏组织IRE1α-XBP1信号的影响，结合体外实验观察IRE1α核酸内切酶选择性抑制剂STF-083010对内质网应激诱导剂衣霉素激活肝细胞IRE1α-XBP1信号和下调胆汁酸合成关键酶CYP7A1的影响，发现孕晚期LPS暴露能激活母鼠肝脏组织IRE1α-XBP1信号，衣霉素处理明显降低了AML12肝细胞汁酸合成酶Cyp7a1的mRNA水平，STF-083010预处理完全阻断了衣霉素对AML12肝细胞胆汁酸合成酶Cyp7a1的mRNA水平的降低作用，表明IRE1α核酸内切酶激活在LPS干扰胆汁酸代谢过程中可能通过下调肝细胞胆汁酸合成酶Cyp7a1的mRNA水平发挥保护性作用。 结论：本研究发现孕期LPS通过干扰胆汁酸合成、转运、分解和紧密连接诱发母体胆汁酸代谢紊乱，改变胆汁酸谱；OCA通过降低胆汁酸合成、增加胆汁酸分解和增强转运过程对LPS诱发胆汁酸代谢紊乱起保护作用；生物节律调控的基因DBP与OCA改善LPS诱发孕期母体胆汁酸代谢紊乱相关；IRE1α核酸内切酶通过降低胆汁酸合成对LPS诱发母体胆汁酸代谢紊乱起保护作用。本研究的发现将为孕期胆汁酸紊乱的预防和治疗提供新的靶点和理论依据。
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