摘要
背景: 甲状腺激素参与调节机体的各种生理功能和病理过程，包括参与碳水化合物、蛋白质和脂类的代谢，影响细胞的增殖和发育，调节对其他激素的反应。甲状腺功能减退可引起全身各系统新陈代谢水平下降，生理功能减退。研究表明甲状腺功能减退症与胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)密切相关,被认为是胰岛素抵抗的危险因素。近期的研究也发现即使在甲状腺功能正常的人群，机体甲状腺激素生理范围内的波动也与胰岛素分泌及其敏感性有关。同样在围产期间，妊娠期未控制的甲状腺功能紊乱与不良的产科和胎儿结局有关，会影响子代的生长以及神经系统发育。近年研究还发现，甲状腺功能减退对于母亲和子代的糖代谢均有不利影响，但其机制尚不十分清楚。 IR分为外周型IR以及肝型IR。外周型IR主要特征在于肌肉组织的葡萄糖摄取和利用异常以及脂肪组织中脂解作用增加，最终游离脂肪酸释放增加。骨骼肌组织是糖脂代谢的重要场所，负责机体约70％-80%的葡萄糖代谢，在全身的能量代谢中发挥重要作用，所以骨骼肌IR的发生发展促进了整个机体IR的进展。近年来关于骨骼肌IR发生的生物学机制已有许多研究，主要包括：骨骼肌线粒体功能缺陷、骨骼肌脂质沉积和炎性反应。骨骼肌组织脂质沉积，如甘油三酯(TG)、游离脂肪酸等脂质的堆积，从而影响胰岛素信号传导通路，最终诱导骨骼肌乃至全身胰岛素抵抗的发生，因此，骨骼肌脂质沉积是诱导骨骼肌IR发生的主要原因之一。线粒体氧化产物的增加促进IR的发展，导致胰岛素信号传导障碍。此外，骨骼肌纤维通过分泌多种骨骼肌因子，如脂联素(adiponectin)、白介素-6(IL-6)、瘦素(leptin)、肿瘤坏死因子(TNF)、抵抗素(resistin)、内脂素(visfatin)等，通过自分泌、旁分泌、内分泌的途径参与体内各种代谢过程，在胰岛素抵抗发病机制中发挥重要的作用，这些研究表明，骨骼肌因子和甲状腺激素具有一些共同的生理效应，包括调节能量消耗和糖、脂代谢。目前甲状腺轴和骨骼肌组织的相互作用机制尚不清楚，考虑骨骼肌胰岛素抵抗及氧化应激等病理生理环节均可能参与其中。 目的: 通过临床试验及动物试验，探讨甲状腺功能减退症对母胎骨骼肌胰岛素抵抗的影响及其可能机制，了解骨骼肌胰岛素抵抗及氧化应激等病理生理环节是否参与甲状腺激素调节母胎糖代谢功能。 方法: 一、临床研究： 1.采用病例对照研究，于安徽医科大学第一附属医院及省妇幼保健院妇科门诊收集临床甲减流产组(Hypo组)和自行要求终止妊娠的正常对照组(Con组)。Hypo组入组标准为TSH＞10mIU/L。通过自制《基本信息记录表》获得受试者基本人口学信息、孕产史、孕期生活情况及相关疾病等情况。 2.空腹静脉血采样后及时分离血清，测定甲状腺功能、甲状腺自身抗体、空腹血糖和空腹血胰岛素，根据公式计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。 3.取绒毛组织，匀浆离心后测定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量。 二、动物实验： 1.雌鼠甲减模型建立： 140只雌性Sprague-Dawley大鼠随机分为两组。正常对照组((Normalgroup，n=50)饮用普通水，丙基硫氧嘧啶(PTU)饮水组(PTUgroup，n=90)饮用0.05%PTU水溶液，6周后随机在两组中各选取6只大鼠取血，测定大鼠甲状腺功能，了解是否成功建立成年期雌性甲状腺功能减退症大鼠模型。 2.甲减妊娠孕鼠模型： 成年雌性大鼠甲减模型造模成功后，分别将正常对照组和PTU饮水组两组大鼠通过雌雄2:1合笼，受孕后分别建立正常妊娠组(NPG，n=21)、甲减妊娠组(HPG，n=39)孕鼠模型。随机分配两组大鼠分别于孕8.5天(E8.5)、孕13天(E13)、孕21天(E21)取两组妊娠大鼠行剖腹产，于孕21天观察胚胎吸收数，计算流产率，分别留取两组孕21天(E21)母鼠以及各亚组(E8.5、E13、E21)胎鼠的血样和骨骼肌。 3.母鼠部分： 用便携式血糖仪检测两组E21母鼠空腹血糖(FBG)，用酶联免疫吸附法(ELISA)法检测母鼠三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、促甲状腺激素(TSH)、胰岛素(FINS)、氧化应激指标超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、脂联素(Adiponectin)和瘦素(Leptin)以及抵抗素(Resistin)水平。Westernblotting分析两组孕21天(E21)母鼠骨骼肌胰岛素信号转导相关蛋白葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)、胰岛素受体底物-1(IRS-1)以及胰岛素受体(IRC)蛋白水平。采用PAS和油红O免疫组织化学染色方法，观察两组母鼠骨骼肌糖原和脂肪的沉积。 4.胎鼠部分： 用ELISA法检测E8.5、E13、E21天胎鼠T3、T4、TSH、FBG、FINS、氧化应激指标丙二醛(MDA)、SOD和GSH-Px、脂联素(Adiponectin)、瘦素(Leptin)、内脂素(visfatin)、鸢尾素(Irisin)、肿瘤坏死因子(TNF-α)以及抵抗素(Resistin)水平。Westernblotting检测E8.5、E13、E21天胎鼠骨骼肌线粒体基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(PGC-1α)、肉毒碱脂酰转移酶1(CPT1)的表达以及骨骼肌胰岛素信号通路相关蛋白GLUT4、IRC、IRS-1及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的蛋白表达。采用PAS和油红O染色，观察两组胎鼠分别在E8.5、E13、E21天骨骼肌糖原和脂肪的沉积。 结果: 临床部分： 1.比较妊娠甲减流产组(Hypo组)和正常妊娠对照组(Con组)两组人群一般情况，我们发现两组受试者年龄及妊娠周龄具有显著差异(P＜0.05)，而两组受试者的教育程度、生活方式(吸烟、饮酒史)、BMI、血压、孕产史均无统计学差异(P＞0.05)。 2.Hypo组及Con组TSH有显著性差异(P＜0.05)。比较两组间FT3、FBG水平，无统计学差异。Hypo组的FT4水平显著低于Con组，Hypo组的FINS、HOMA-IR水平以及TPOAb阳性比例显著高于Con组(P＜0.05)。 3.比较两组间绒毛组织SOD、MDA水平，Hypo组绒毛组织SOD水平较Con组降低，MDA水平较Con组升高，但无统计学差异(P＞0.05)。 动物实验部分： 1.母鼠部分： 1.1本实验成功建立甲状腺功能减退症雌鼠模型，在妊娠模型中，我们观察到与正常对照组相比，PTU饮水组的受孕率未见明显差异。甲减妊娠组和正常妊娠组相比，流产率增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。 1.2比较甲减妊娠组和正常妊娠组两组孕21天母鼠胰岛素(FINS)水平，甲减妊娠组显著高于正常妊娠组(P＜0.05)，两组间空腹血糖(FBG)无显著差异。 1.3甲减妊娠组孕21天母鼠骨骼肌匀浆中SOD和GSH-Px水平明显低于正常妊娠组(P＜0.05)。 1.4与正常妊娠大鼠比较，甲减妊娠母鼠的骨骼肌匀浆中脂联素、瘦素以及抵抗素水平均明显升高(P＜0.05)。 1.5甲减妊娠母鼠骨骼肌GLUT4、IRS-1和IRC蛋白的表达水平均低于正常妊娠组(P＜0.05)。 1.6甲减妊娠母鼠骨骼肌PAS和油红O染色阳性率均明显高于正常妊娠组(P＜0.05)。 2.胎鼠部分 2.1测定不同胎龄胎鼠的甲状腺功能指标，结果显示甲状腺激素水平(T3、T4)和促甲状腺激素(TSH)随胎龄的增长而升高，提示胎鼠垂体-甲状腺轴功能随着胎龄增长在发育成熟。在21天胎龄亚组中，我们观察到PTU组的T3水平显著低于同胎龄的正常妊娠组，TSH水平显著高于同胎龄的正常妊娠组(P＜0.05)，而T4在甲减妊娠组和正常妊娠组之间差异不显著。 2.2随着胎鼠胎龄的增加，甲减妊娠组和正常妊娠组胎鼠的FBG、FINS、HOMA-IR、TG和TC均呈升高趋势(P＜0.05)。与同胎龄的正常妊娠组相比，甲减妊娠组的FBG、FINS、HOMA-IR、TG和TC均随胎龄的增加而升高，仅甲减妊娠组21天胎龄亚组胎鼠的TC较同胎龄的正常妊娠组胎鼠显著升高(P＜0.05)，其余指标两组之间差异不显著。 2.3结果显示在两组胎鼠的21天胎龄亚组(E21组)中，骨骼肌组织中MDA水平均明显高于同组8.5天胎龄组(P＜0.05)，而E13组与E8.5组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。GSH-Px、SOD和CAT水平在E13和E21组明显高于E8.5组(P＜0.05)。各胎龄甲减妊娠组与正常妊娠组相比，MDA、GSH-Px、SOD、CAT水平均无显著性差异(P＞0.05)。 2.4除正常组E13亚组的脂联素(Adiponectin)和PTU组E13亚组的鸢尾素(irisin)外，甲减妊娠组和正常妊娠组的E13和E21亚组胎鼠的脂联素(Adiponectin)、瘦素(Leptin)、内脂素(Visfatin)、抵抗素(Resistin)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平分别显著高于同组E8.5亚组，差异有统计学意义(P＜0.05)。与正常妊娠组的E21亚组的TNF-α相比较，甲减妊娠组E21亚组TNF-α水平显著升高(P＜0.05)。但在胚胎发育不同阶段，同胎龄的甲减妊娠组与正常妊娠组两组间脂联素(Adiponectin)、瘦素(Leptin)、内脂素(Visfatin)、抵抗素(Resistin)、鸢尾素(irisin)水平无明显差异(P＞0.05)。 2.5随着胎鼠发育，参与骨骼肌线粒体氧化的蛋白质水平逐渐升高，结果显示，与E8.5相比，甲减妊娠组和正常妊娠组的E21亚组的线粒体相关蛋白过氧化物酶体增殖物激活受体-γ辅助激活剂-1α(PGC-1α)和肉毒碱棕榈酰转移酶1(CPT1)均显著增加(P＜0.05)。但在胚胎发育不同阶段，同胎龄的甲减妊娠组与正常妊娠组比较，PGC-1α和CPT1水平差异均无统计学意义(P＞0.05)。 2.6随着胎鼠发育，骨骼肌胰岛素信号转导的蛋白质水平逐渐升高。结果显示，与E8.5相比，甲减妊娠组和正常妊娠组的E21亚组的葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)、胰岛素受体底物-1(IRS-1)、胰岛素受体(IRC)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)蛋白表达水平均升高，除了甲减妊娠组GLUT4无统计学意义(P＞0.05)，余指标均有显著差异(P＜0.05)。在胚胎发育不同阶段，同胎龄的甲减妊娠组与正常妊娠组比较差异无显著性(P＞0.05)。 2.7骨骼肌PAS染色显示，在E8.5、E13和E21亚组，甲减妊娠组和正常妊娠组骨骼肌胞浆内均有葡萄糖原存在，且PAS染色阳性率随胎龄的增加而增加。骨骼肌冰冻切片油红O染色显示甲减妊娠组E13、E21组有脂质异位沉积，与E8.5组比较有显著性差异(P＜0.05)。但同胎龄时，甲减妊娠组与正常妊娠组相比，肌糖原和脂肪沉积无显著差异(P＞0.05)。 结论: 1.动物实验提示甲状腺功能减退可以促进母鼠胰岛素抵抗以及骨骼肌脂肪异位沉积。 2.动物实验提示，随着胎鼠的生长，胎鼠的甲状腺功能逐步完善。IRS-1、IRC、PI3K、GLUT4蛋白均可在胎鼠骨骼肌组织中表达。在胚胎发育的不同阶段，胎鼠骨骼肌脂肪因子、PGC-1α、CPT1、GLUT4、IRC、IRS-1及PI3K蛋白质水平逐步升高。 3.母体甲状腺功能减退可以影响母体及子代糖代谢，骨骼肌胰岛素抵抗与骨骼肌组织氧化应激失衡不是母体甲减对子代糖代谢影响的核心环节。
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