摘要
由于我国经济的高速发展以及城市化的加剧，发达国家所经历的不同工业发展阶段的大气污染问题在我国以压缩的方式同时集中显现。污染情况最为突出的便是近年来频发的雾霾事件，其强度高、持续时间长且涉及区域广。我国大气细颗粒物(PM2.5)来源与成因十分复杂，其毒性组分和毒理学机制尚不清楚，国外的研究模式与结果解析不能很好的适用于我国PM2.5的污染情况。因此，结合我国大气雾霾的特点，开展大气细颗粒物的健康危害与分子机制研究，将有助于理解我国雾霾对人群健康的危害，从而推动我国环境污染与健康研究的发展。为此本课题拟首先基于表观遗传调控探讨PM2.5与气态污染物SO2、NO2复合暴露对肺损伤的影响，在此基础上，针对PM2.5研究不同生命阶段小鼠对PM2.5的易感性，并针对易感性最强的小鼠探究PM2.5暴露后的恢复效应，最后，建立PM2.5孕期暴露模型，探讨PM2.5孕期暴露对子代小鼠肺发育的影响，综合评估大气污染诱发肺损伤的毒性效应及分子机制。 1、大气污染物在慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发生发展中起重要作用，且肺动脉高压(PH)是COPD常见的临床表征。然而，大量实验研究主要集中在单一污染物的健康危害效应而忽视了其复合污染的毒性效应。在本研究中，我们将C57BL/6小鼠随机分为三组：对照组(隔天吸入生理盐水，每天吸入洁净空气)，低浓度组(隔天吸入1mg/kg体重PM2.5，每天动力学吸入0.5mg/m3SO2和0.2mg/m3NO2(6h/d))和高浓度组(隔天吸入3mg/kg体重PM2.5，每天动力学吸入3.5mg/m3SO2和2mg/m3NO2(6h/d))。4周暴露结束后，采用Anires2005系统检测子鼠肺功能(第0.1秒用力呼气肺活量(FEV0.1)/用力肺活量(FVC))，并通过苏木精-伊红(HE)染色以及透射电子显微镜(TEM)观察肺组织病理学以及超微改变。在此基础上，利用过免疫印迹技术检测肺动脉高压标志因子(内皮素-1(ET-1)和内皮一氧化氮合酶(eNOS))的表达。随后，利用microRNAs(miRNAs)芯片筛查以及实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术考察miRNA表达谱的变化，同时利用双荧光素酶报告基因考察差异miRNA对靶基因的调控。结果表明，PM2.5与SO2、NO2复合暴露能够引起小鼠呼吸道气流受限，组织病理学和超微结构改变，且能够改变ET-1和eNOS的表达，表明复合暴露能够引起小鼠肺动脉高压样损伤。miRNA基因芯片结果显示有三个人源的MicroRNA(miR-338-5p、miR-450b-3p和miR-142-5p)发生显著变化，且miR-338-5p与肺损伤相关性最强。另外，miR-338-5p可以结合于缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的3'-非编码区(3'-UTR)，从而导致HIF-1α及其相关基因four-and-a-halfLIM(Lin-11, Isl-1 and Mec-3)domain1(Fhl-1)表达的上升，进而促进PH的发生。这一研究为复合暴露诱导肺损伤过程中miRNAs的调控作用提供了理论依据。 2、PM2.5本身作为一种复合物，与众多呼吸系统疾病相关。然而，有关PM2.5与肺损伤相关性的实验研究大都集中在同一年龄段，缺乏不同年龄段之间的比较。因此，我们建立不同生命阶段小鼠PM2.5吸入暴露模型，即对不同年龄(4周龄(4W)，4月龄(4M)，10月龄(10M))的小鼠进行鼻腔闭气经口吸入PM2.5染毒处理(3mg/kg体重)，隔天吸入，暴露4周。采用Anires2005系统检测小鼠肺功能(FEV0.1、FVC和气道高反应性(AHR))，并通过HE染色观察肺组织病理学。另外，考察肺组织中活性氧簇(ROS)水平以及抗氧化酶(超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px))的活性。最后，通过RT-PCR检测炎性因子肿瘤坏死因子-α(Tnf-α)和白介素-1β(Il-1β)的表达水平。结果表明，PM2.5暴露能够改变4W和10M小鼠的肺功能，同时能够引起不同生命阶段小鼠的气道高反应性。HE染色结果提示PM2.5暴露能够导致4W以及10M小鼠的气道结构发生改变。另外，PM2.5暴露能够导致4W和10M小鼠ROS水平升高以及10M小鼠抗氧化酶活性改变，引起4W和10M小鼠的炎性因子水平升高。以上研究结果比较了PM2.5暴露诱导不同生命阶段肺损伤的易感性，提示10M小鼠最为敏感，为寻求预防和减缓效应发生的最佳时机，也为污染地区健康防护和临床治疗提供理论依据。 3、先前的流行病学以及动物学实验逐步为PM2.5对健康影响的潜在机制提供了大量研究数据。然而，关于雾霾污染结束后肺部恢复过程还鲜有报道。因此，本研究针对易感性最强的10M小鼠，建立暴露PM2.5暴露与恢复模型，目的在于探究PM2.5暴露结束后肺部损伤的恢复过程及其机制。本研究将10MC57BL/6小鼠吸入暴露3mg/kg体重的PM2.52周或4周，4周暴露结束后停止暴露，恢复1周或2周。采用Anires2005系统检测小鼠肺功能(FEV0.1、FVC和AHR)，同时通过瑞氏-吉姆萨染色考察肺泡灌洗液(BALF)中细胞的数目以及颗粒物负载。同时，利用免疫印迹(western blot)以及酶联免疫法(ELISA)检测了H3K27ac以及组蛋白去乙酰化酶和组蛋白乙酰转移酶的表达量。另外，结合染色质免疫共沉淀测序技术(ChIP-seq)分析了与H3K27ac结合的DNA的改变。最后，利用ELISA分析了与H3K27ac相关的炎性因子以及趋化因子的水平。研究结果表明PM2.5暴露4周显著降低了小鼠的肺功能，增加了BALF中总细胞和巨噬细胞的数目，且增加了巨噬细胞中颗粒物负载。另外，这些变化在暴露结束1周后逐渐恢复到了正常水平。然而，肺泡中的颗粒物负载在恢复2周后仍然存在。PM2.5暴露4周显著改变了H3K27ac以及调控其表达的相关酶(组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC))的水平。同时，ChIP-seq结果表明PM2.5暴露诱导的与H3K27ac结合发生改变的基因主要参与了免疫系统过程、趋化因子信号通路，其中信号转导和转录激活因子2(Stat2)和乳腺癌抗雌激素耐药基因(Bcar1)是其中两个重要的基因。另外，PM2.5暴露4周显著影响了促炎因子以及趋化因子的表达，而这些改变在暴露2周后恢复到正常水平。综上所述，目前的研究表明PM2.5暴露4周后引起的肺功能下降和由组蛋白修饰介导的炎性因子上升可以在2周内恢复。然而，肺泡中持续性颗粒负载可能是肺部疾病的长期潜在风险。 4、前期建立的多种颗粒物暴露模型已经证实了颗粒物本体暴露与呼吸系统损伤的相关性。然而，颗粒物污染对呼吸系统健康的影响起始于胎儿期，孕期PM2.5暴露能够增加子代后期罹患呼吸系统疾病的风险，且关于孕期PM2.5暴露与子代肺发育的相关性研究还鲜有报道。本研究的目的为考察孕期PM2.5暴露是否会引起子代支气管肺发育不良(BPD)的症状，如果是，这些不良影响能否随着后期的发育逐渐恢复。本研究建立了PM2.5孕期暴露模型，即将妊娠期小鼠从妊娠期第一天开始隔天通过鼻腔闭气经口法吸入PM2.5(3mg/kg体重)直到妊娠结束。在胚胎期18.5天(E18.5)，取母鼠胎盘和肺组织，分析胎盘重金属含量以及母鼠肺组织和胎盘组织中的炎性因子表达。在子代小鼠出生后，分别在1、7、14、21天处死子鼠，取肺组织通过HE染色分析其肺泡化，通过免疫荧光染色、westernblot以及RT-PCR分析肺血管发育，通过免疫组化、TEM以及RT-PCR考察分泌功能发育，同时通过RT-PCR考察肺组织炎性的表达。最后，通过Anires2005系统检测子鼠肺功能(FEV0.1、FVC)。结果表明，孕期PM2.5暴露能够造成胎盘中Pb和Mn的含量升高，并引起母鼠肺组织和胎盘组织炎性反应。另外，孕期PM2.5暴露引起子代小鼠典型的BPD症状，包括低肺泡化，血管生成减少，分泌蛋白和表面活性蛋白的表达受到抑制，以及炎性因子水平升高，且雄性子鼠比雌性子鼠更为敏感。然而，这些改变随着子鼠发育逐渐恢复到正常水平。 本论文首先基于miRNA表观调控，探讨了PM2.5与气态污染物复合暴露诱导肺损伤的分子机制；在此基础上，针对PM2.5建立不同生命阶段暴露模型，阐明不同生命阶段肺损伤易感性；随后，针对易感性最明显的中老年小鼠建立PM2.5暴露与恢复模型，从组蛋白修饰角度研究PM2.5暴露诱导中老年小鼠肺损伤的恢复效应与机制；最后，基于成人疾病胎源说，建立PM2.5孕期暴露模型，阐明其对子代小鼠肺发育的影响，从根源上明确成年后期疾病易感性增加的原因。本研究建立了多种暴露模型，利用了多种表观遗传机制，多角度多维度地研究了大气污染对呼吸系统的损伤效应及分子机制，为我国环境污染与健康领域研究的发展提供了科学依据。
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