摘要
结肠癌(colon cancer)是较为常见的消化道恶性肿瘤之一，具有治疗难度大、发病率高及死亡率高等特点。结肠癌的发病率在消化道肿瘤中位于第2位，并且在全球范围内呈现逐渐攀升趋势。对于早期或局部转移患者，如果能获得根治性手术的机会，预后一般较好；对于晚期患者，常常丧失根治性手术的机会，而是采用放疗、化疗、对症支持治疗等治疗手段，预后一般较差。因此，安全、有效的治疗策略对于结肠癌治疗来说是很有必要的。 嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy)是肿瘤免疫治疗的重要手段之一。嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T)是一类经过整合嵌合抗原受体(chimeric Antigen Receptor，CAR)基因修饰，能够特异性消灭肿瘤细胞的免疫细胞。CAR可以特异性识别肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)或者肿瘤特异性抗原(tumor-specific antigen，TSA)，随后将信号传递至T细胞，引起T细胞激活和增殖，从而有效杀伤肿瘤细胞。2017年美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)已经先后批准了诺华制药公司的CAR-T药物Kymriah和Kite制药公司的Yescarta上市，用于血液系统疾病的治疗并取得了惊人成绩。近年来的研究发现，CAR-T免疫疗法对实体瘤也有一定的治疗效果。 NKG2D(natural killer group 2 member D)是NK细胞凝集素样受体家族Klrk1基因编码的一种重要激活受体。它主要存在于小鼠和人的NK细胞上，在人的CD8+T细胞上组成性表达，但仅在小鼠T细胞活化时表达。人类NKG2D能够识别多种高度多样化的配体，包括MICA、MICB、ULBP1、ULBP-2、ULBP-3、ULBP-4、ULBP5和ULBP6等。一般情况下，NKG2D配体在正常细胞上是不存在的，但可以被各种刺激所诱导。在肿瘤细胞上，NKG2D配体与NKG2D结合，随后激活NK细胞并参与免疫细胞介导的杀伤作用。由此可见，NKG2D配体可以作为CAR-T细胞治疗的高效靶蛋白。 在本研究中，我们将利用非病毒微环DNA载体构建NKG2DCAR，并将其转染T细胞，获得第三代NKG2DCAR-T细胞，并探讨该细胞对人结肠癌细胞的体外、体内杀伤作用。非病毒载体可以避免病毒复制、细菌复制等风险，具有很好的安全性。因此，本研究将为结肠癌乃至其他实体瘤的治疗提供新的作用靶点和思路，具有重要的临床应用价值。 第一部分：NKG2D嵌合抗原受体T细胞的制备和功能检测 目的：构建嵌合抗原受体NKG2DCAR微环DNA，制备和验证NKG2DCAR-T细胞。 方法：根据参考文献和Genebank，确定NKG2DCAR的氨基酸序列。按照CD8α信号肽序列、人NKG2D胞外区序列、人CD8α铰链区序列、人CD28跨膜区序列和胞内区序列、人4-1BB胞内信号序列、人CD3ζ胞内信号序列的顺序确定NKG2DCAR的结构。此外，分别将EcoRI和BamHI两个酶切位点放置在整段NKG2DCAR基因序列的前端和后端，形成NKG2DCAR的全基因序列。合成NKG2DCAR全基因序列，并连接到pUC57大肠杆菌基因克隆质粒中，命名为NKG2DCAR-pUC57质粒。对NKG2DCAR-pUC57进行EcoRI和BamHI双酶切，使用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，回收NKG2DCAR片段。将NKG2DCAR片段与亲本微环DNA进行连接反应后，转化到特殊感受态菌ZYCY10P3S2TE.coli中，在含有卡那霉素的LB固体培养基中培养。挑取2个单克隆菌落，摇菌，提取NKG2DCAR微环DNA质粒。对质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳检测。利用密度梯度离心法从人外周血中分离出T淋巴细胞，采用电穿孔法将NKG2D微环DNA质粒转到T淋巴细胞中，获得NKG2DCAR-T细胞。每隔2天传代或换液一次，换液前进行细胞计数。利用台盼蓝染色计算细胞存活率，利用荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表达情况，利用共聚焦显微镜观察细胞的NKG2D和GFP表达情况以及细胞定位，利用流式细胞术观察细胞的NKG2D和GFP表达情况，利用Westernblotting检测细胞的CD3ζ表达情况，利用流式细胞仪检测细胞中CD4+和CD8+细胞亚群的比例。 结果： 1.琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，凝胶中可见一个约1200bp大小的条带，条带大小与实验设计的NKG2DCAR一致，此即为NKG2DCAR片段，提示NKG2DCAR-pUC57质粒构建成功。 2.倒置培养过夜后，LB固体培养基中肉眼可见密布的单克隆菌落，提示NKG2DCAR亲本微环DNA质粒顺利转化到感受态细菌中，获得卡那霉素抗性。 3.提取2个单克隆菌落质粒，双酶切、琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，二号单克隆菌落所提质粒呈现一个约1200bp大小的条带，条带大小与实验设计的NKG2DCAR一致，提示二号菌落所提取得NKG2DCAR微环DNA质粒包含NKG2DCAR片段，NKG2DCAR微环DNA质粒构建成功。基因测序结果显示，NKG2DCAR微环DNA中的目的片段未发生基因突变，并包括完整基因序列。 4.经过FICOLL分离液处理后，每个人外周血去白细胞过滤器可以获得3×106至5×106个淋巴细胞。倒置显微镜下观察可见，淋巴细胞悬浮生长，呈圆形或椭圆形；另有少量体积较大、形态不规则细胞呈贴壁生长。细胞培养12h之后，淋巴细胞开始聚集成团、形成增殖集落；同时，体积较大、形态不规则细胞的数量明显减少。 5.电转后，台盼蓝染色结果显示，正常T细胞的存活率达97%，NKG2DCAR-T细胞的存活率达76%。由此可见电穿孔法对细胞的存活率有一定影响。 6.细胞计数结果显示，正常T细胞和NKG2DCAR-T细胞在培养12天后显示出相似的扩增率，扩增比例均达到5-6倍；此外，NKG2DCAR-T细胞在第2-4天的数量显著下降，这可能是电穿孔导致的细胞损伤。 7.荧光显微镜观察结果显示，GFP在NKG2DCAR微环DNA载体转染T细胞后电转24h开始出现明显表达，转染后48h达到高峰表达，并至少持续到72h以上。 8.共聚焦显微镜检测结果显示，NKG2D和GFP在CAR-T细胞中的表达明显强于正常对照组T细胞，而且NKG2D蛋白主要定位于细胞膜和胞浆，提示NKG2DCAR可以顺利折叠并与T细胞膜特异性结合。 9.Westernblotting检测结果显示，NKG2DCAR-T细胞和正常对照组T细胞均具有内源性CD3ζ表达，但是NKG2DCAR-T细胞还有外源性CD3ζ表达，而正常对照组T细胞无外源性CD3ζ表达。 10.流式细胞仪检测结果显示，与正常对照组T细胞相比，CD4+的NKG2DCAR-T细胞比例略有升高，CD8+的NKG2DCAR-T细胞比例略有降低。 小结： 1.通过基因重组技术，成功制备了NKG2DCAR微环DNA质粒。 2.通过电穿孔技术，成功地将NKG2DCAR微环DNA质粒转到人外周血淋巴细胞中并在体外培养、扩增，成功获得NKG2DCAR-T细胞。 3.人结肠癌细胞LS174T表达高水平的MICA和ULBP-3，HCT-116细胞表达高水平的MICA、MICB、ULBP-2/5/6和ULBP-3。 第二部分：NKG2D嵌合抗原受体T细胞对人结肠癌细胞杀伤作用的体外研究 目的：观察CAR-T细胞的功能及对人结肠癌细胞株的体外杀伤作用。 方法：复苏人结肠癌细胞株LS174T和HCT-116到细胞培养瓶中，加入含1%青链霉素双抗、10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于5%二氧化碳、37℃细胞培养箱中培养。倒置显微镜下观察细胞形态，待细胞充分贴壁后，每2天更换一次培养基。细胞贴壁生长至90%融合度时，根据1∶3-1∶4的扩增倍数，采用胰蛋白酶EDTA消化法进行细胞传代。使用流式细胞仪检测MICA、MICB、ULBP-1、ULBP-2/5/6和ULBP-3等NKG2D配体在人结肠癌细胞株LS174T和HCT-116的表达情况。将正常T细胞或NKG2DCAR-T细胞分别与LS174T或HCT-116细胞按照5∶1、10∶1和20∶1的效应细胞:靶细胞比例(effector∶targetcellratios,E∶T)共同培养24h，使用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit)，分别检测NKG2DCAR-T细胞对LS174T和HCT-116的细胞毒性。此外，使用酶联免疫吸附检测试剂盒(enzyme-linked immunosorbent assay ， ELISA)，分别检测NKG2DCAR-T与LS174T或HCT-116结肠癌共培养时IL-2和IFN-γ等细胞因子的释放情况。 结果： 1.流式细胞仪检测结果显示，人结肠癌细胞LS174T表面的MICA和ULBP-3高表达，MICB、ULBP1和ULBP-2/5/6低表达。 2.流式细胞仪检测结果显示，人结肠癌细胞HCT-116表面的MICA、MICB、ULBP-2/5/6和ULBP-3高表达，ULBP1低表达。 3.乳酸脱氢酶细胞毒性检测结果显示，与正常对照T细胞相比，NKG2DCAR-T细胞对LS174T细胞在各E∶T均表现出更强的杀伤作用。当E∶T为20∶1时，NKG2DCAR-T细胞对LS174T的杀伤效果最佳，杀伤率达到47%。 4.乳酸脱氢酶细胞毒性检测结果显示，与正常对照T细胞相比，NKG2DCAR-T细胞对HCT-116细胞在各E∶T均表现出更强的杀伤作用。当E∶T为20∶1时，NKG2DCAR-T细胞对HCT-116的杀伤效果最佳，杀伤率达到52%。 5.ELISA检测结果显示，与正常对照组T细胞相比，NKG2DCAR-T细胞能释放出大量IL-2。其中，NKG2DCAR-T细胞与LS174T细胞共培养24h，培养基中IL-2的浓度达到为3265.83±840.45pg/mL；NKG2DCAR-T细胞与HCT-116细胞共培养24h，培养基中IL-2的浓度达到为4855.71±1166.61pg/mL。 6.ELISA检测结果显示，与正常对照组T细胞相比，NKG2DCAR-T细胞能释放出大量IFN-γ。其中，NKG2DCAR-T细胞与LS174T细胞共培养24h，培养基中IFN-γ的浓度达到为8621.43±1594.91pg/mL；NKG2DCAR-T细胞与HCT-116细胞共培养24h，培养基中IFN-γ的浓度达到为10757.14±2163.74pg/mL。 小结： 1.体外研究结果显示，NKG2DCAR-T细胞对人结肠癌细胞LS174T和HCT-116均具有良好的杀伤作用，且杀伤效率与效靶比呈正相关。 2.NKG2DCAR-T细胞能够分泌大量IL-2和IFN-γ等细胞因子。 第三部分：NKG2D嵌合抗原受体T细胞对人结肠癌细胞杀伤作用的体内研究 目的：建立HCT-116异种移植NOD/SCID小鼠模型，观察NKG2DCAR-T细胞在体内对人结肠癌细胞杀伤作用。 方法：复苏人结肠癌细胞HCT-116-Luc到培养瓶中，加入含1%青链霉素双抗、10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于5%二氧化碳、37℃细胞培养箱中培养。倒置显微镜下观察结肠癌细胞的形态，待细胞充分贴壁后，每2天更换一次培养基。细胞贴壁生长至90%融合度时，根据1∶3-1∶4的扩增倍数，采用胰蛋白酶EDTA消化法进行细胞传代。向刚刚传代的人结肠癌细胞株HCT-116-Luc的培养基中加入潮霉素B溶液，经过3-4次传代，筛选具有潮霉素B抗性的HCT-116-Luc细胞。在无特定病原体动物(Specific Pathogen Free，SPF)级动物实验室饲养雄性NOD/SCID小鼠(non-obesediabetic/severe-combinedimmunodeficientmice，非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠)，于小鼠右肩背皮下注射HCT-116-Luc肿瘤细胞悬液(1×106个/只)，建立小鼠皮下结肠癌移植瘤模型。当肿瘤负荷达到150-250mm3时，根据肿瘤体积大小和体重，结合实验设计方案，将小鼠随机分为3组：(1)正常对照组(control group)：NOD/SCID小鼠5只，正常饲养，分别于治疗第0天和第7天给予PBS注射、干预；(2)T细胞治疗组(T cells group)：NOD/SCID小鼠5只，分别于治疗第0天和第7天给予正常T细胞治疗、干预；(3)NKG2DCAR-T细胞治疗组(NKG2D CAR-T cells group)：NOD/SCID小鼠5只，分别于治疗第0天和第7天给予NKG2DCAR-T细胞治疗、干预。治疗期间观察小鼠精神状态、毛发情况以及是否存在腹泻、治疗后过敏反应等情况，记录小鼠生存时间。每5天记录一次小鼠体重和肿瘤体积，绘制小鼠体重及肿瘤生长曲线。于治疗后第20天，利用小鼠活体成像仪分析观察肿瘤生长情况。于治疗第25天，处死小鼠，切取、称量肿瘤以及心、肝、肺、脾、肾等重要器官、组织，置于4%多聚甲醛通用型组织固定液，用于免疫组化检测和常规苏木素-伊红染色(hematoxylin and eosin，HE)。 结果： 1.通过向NOD/SCID小鼠右肩背部皮下注射人结肠癌细胞HCT-116-Luc，成功构建小鼠皮下结肠癌移植瘤模型，12天全部成瘤。将小鼠分为正常对照组、T细胞治疗组和NKG2DCAR-T细胞治疗组。 2.体重测量结果显示，治疗期间，正常对照组小鼠体重略有升高，T细胞治疗组小鼠体重变化不明显，但是NKG2DCAR-T细胞治疗组小鼠体重有所下降。 3.活体动物成像结果显示，与正常对照组和T细胞治疗组相比，NKG2DCAR-T细胞治疗组小鼠的肿瘤生长受到明显抑制。 4.游标卡尺测量结果显示，治疗期间，正常对照组、T细胞治疗组小鼠的肿瘤体积进一步快速增加，但是NKG2DCAR-T细胞治疗组小鼠的肿瘤体积增加速度明显减缓。 5.生存时间记录结果显示，NKG2DCAR-T细胞治疗组小鼠生存时间长于正常对照组和T细胞治疗组。 6.免疫组织化学检测结果显示，与正常对照组和T细胞治疗组相比，NKG2DCAR-T细胞治疗组小鼠的肿瘤组织周围有大量淋巴细胞浸润。 7.HE染色检测结果显示，NKG2DCAR-T细胞治疗组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织切片均未发现明显的形态学改变，具有很好的安全性。 小结： 1.通过向NOD/SCID小鼠右肩背部皮下注射人结肠癌细胞HCT-116-Luc，成功构建小鼠皮下结肠癌移植瘤模型。 2.NKG2DCAR-T细胞治疗导致小鼠体重下降、生存时间延长，肿瘤生长受到抑制。 3.NKG2DCAR-T细胞能够浸润到小鼠的肿瘤组织周围，未导致心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等重要脏器的形态学改变，具有很好的安全性。 结论: 1.通过基因重组技术，成功制备了NKG2DCAR微环DNA质粒。通过电穿孔技术，成功地将NKG2DCAR微环DNA质粒转到人外周血淋巴细胞中并在体外培养、扩增，成功获得NKG2DCAR-T细胞。 2.人结肠癌细胞LS174T表达高水平的MICA和ULBP-3，HCT-116细胞表达高水平的MICA、MICB、ULBP-2/5/6和ULBP-3。 3.体外研究结果显示，NKG2DCAR-T细胞对人结肠癌细胞LS174T和HCT-116均具有良好的杀伤作用，且杀伤效率与效靶比呈正相关；同时NKG2DCAR-T细胞能够分泌大量IL-2和IFN-γ等细胞因子。 4.体内研究结果显示，通过向NOD/SCID小鼠右肩背部皮下注射人结肠癌细胞HCT-116-Luc，成功构建小鼠皮下结肠癌移植瘤模型。NKG2DCAR-T细胞治疗导致小鼠体重下降、生存时间延长，肿瘤生长受到抑制。NKG2DCAR-T细胞能够浸润到小鼠的肿瘤组织周围，未导致心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等重要脏器的形态学改变，具有很好的安全性。
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