摘要
老年性耳聋(Age-related hearing loss，AHL)是指随着年龄的增加双耳听力对称性、进行性下降，且以高频听力下降为主要特征的听力损失。目前研究认为耳蜗螺旋神经元(Spiral Ganglion Neurons，SGN)凋亡、退变在老年性耳聋中发挥重要作用。SGN是听觉传导通路的一级神经元，它将毛细胞传递来的听觉信号编码为神经冲动，并进一步上传至听觉中枢形成声音，但是老年性耳聋中SGN功能障碍和损伤的机制还不清楚。 T型钙通道(又名低电压激活钙通道，Low-voltageactivatedcalciumchannels，LVA)是电压门控钙离子通道的一个亚家族，广泛存在于心脏、血管、耳蜗、等组织和细胞中，并且发挥重要的生理作用。研究发现，给予小鼠具有抑制T型钙通道作用的抗癫痫药三甲双酮和乙琥胺可以抑制SGN损伤，改善老年小鼠听力。我们前期预实验发现：在老年性耳聋小鼠SGN上T型钙通道的三个亚型Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3mRNA表达水平明显增高。但是T型钙通道是否介导SGN损伤而参与老年性耳聋？其作用机制是什么？尚不清楚。 我们构建了老年性耳聋小鼠模型，观察老年性耳聋小鼠SGN三种T型钙通道亚型Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3的表达、分布情况，探讨其对SGN凋亡的影响，揭示SGN上T型钙通道在老年性耳聋中的作用及其机制，我们的研究为进一步认识、预防和延缓老年性耳聋的发生提供理论数据。 目的：探讨SGN上T型钙通道在老年性耳聋中的作用及机制。 方法： 1)构建老年性耳聋模型小鼠，并通过检测不同年龄段C57BL/6小鼠的听觉脑干反应(ABR)，检查小鼠听力情况，对老年性耳聋小鼠模型进行评价； 2)采用real-timePCR，免疫荧光染色技术检测年轻及老年性耳聋小鼠耳蜗组织中T型钙通道三个亚型表达情况；利用膜片钳技术检测和对比年轻和老年性耳聋小鼠SGN上T型钙通道电流； 3)利用HE染色方法检测年轻及老年性耳聋小鼠SGN形态及数量的变化；利用免疫荧光染色技术检测老年性耳聋小鼠SGN中凋亡分子AIF及cleavedcaspase-3的表达情况；采用real-timePCR、Western-Blot技术及免疫荧光染色技术检测年轻和老年性耳聋小鼠SGN中AIF的调控分子calpain1和calpain2的表达情况； 4)体外培养SGN，使用D-半乳糖制备SGN老化模型，分别孵育T型钙通道抑制剂和calpain2抑制剂，免疫荧光染色技术观察AIF的核转位情况。 结果： 1.老年性耳聋小鼠模型制备：与年轻小鼠听力阈值相比，老年小鼠ABR阈值明显升高，且高频听力丧失严重； 2.老年性耳聋小鼠耳蜗组织T型钙通道亚型Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3的mRNA表达水平均升高，Cav3.1和Cav3.2蛋白表达水平升高；T型钙离子通道电流在老年性耳聋小鼠SGN上显著增加； 3.老年性耳聋小鼠SGN数量明显减少；凋亡相关蛋白AIF在SGN中被激活，发生了由胞浆向细胞核的移位。AIF的调控分子calpain1的mRNA的表达水平在年轻与老年性耳聋小鼠之间无明显差异；而另一个AIF调控分子calpain2的mRNA及蛋白的表达水平在老年性耳聋小鼠耳蜗组织中明显升高； 4.300mM的D-半乳糖可以引起SGN上AIF由胞浆向细胞核移位，引起SGN凋亡，孵育T型钙通道阻断剂和calpain2的抑制剂后，可抑制SGN上AIF核移位现象。 结论：在老年性耳聋小鼠SGN上，T型钙通道表达上调，通道电流增加，可通过calpain2途径激活AIF，介导SGN凋亡，导致听力下降。
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