摘要
本文主要从以下几部分进行论述： 第一部分:MicroRNA-100在胃癌细中的表达及对胃癌细胞生物学功能的影响 目的:探讨microRNA-100在胃癌细胞和组织中的表达情况，并分析microRNA-100对胃癌细胞生物学功能的影响。 方法:1.体外培养胃癌细胞BGC823和正常胃细胞系GES-1，通过RT-PCR法检测胃癌细胞BGC823和正常胃细胞系GES-1中microRNA-100的表达水平，比较microRNA-100在胃癌细胞与正常胃细胞系GES-1的表达差异;2.收集本院确诊手术治疗的39例胃癌患者的癌组织和癌旁组织标本，液氮冻存，采用RT-PCR法检测39例配对癌组织和癌旁组织中microRNA-100的表达水平，比较microRNA-100在癌组织与癌旁组织的表达差异，并结合临床数据，应用卡方检验以及Pearson相关性分析microRNA-100表达与胃癌患者临床病理参数的相关性，并应用Kaplan Meier生存函数分析microRNA-100表达与患者生存率的关系，最后应用COX多因素分析影响胃癌患者预后的独立危险因素;3.体外培养BGC823细胞，在BGC823细胞中分别转染microRNA-100 inhibitor、microRNA-100 mimic，然后采用MTT增殖、划痕迁移、transwell侵袭实验方法，评价microRNA-100的表达对BGC823细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。 结果:1.体外细胞RT-PCR检测结果显示:与正常胃细胞系GES-1比较，BGC823细胞中microRNA-100表达明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01);2.39例胃癌患者的癌组织和癌旁组织中RT-PCR检测结果显示:与癌旁组织比较，microRNA-100在胃癌组织表达明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.01);3.卡方检验以及Pearson相关性分析显示:microRNA-100表达与淋巴结转移(r=0.387，P=0.047)，肿瘤大小(r=-0.351，P=0.034)及肿瘤分期（r=0.347，P=0.008）密切相关。Kaplan Meier生存函数分析显示:microRNA-100表达明显降低的患者5年总生存率低于高表达的患者，差异有统计学意义(P＜0.05)。COX多因素分析显示，microRNA-100、肿瘤大小、肿瘤分期以及淋巴结转移是影响胃癌患者预后的独立危险因素;4.体外细胞实验显示:BGC823细胞转染microRNA-100 inhibitor、microRNA-100 mimic后，与对照组比较，microRNA-100 inhibitor组细胞microRNA-100表达更低，而microRNA-100mimic组microRNA-100表达明显升高。MTT增殖、划痕和transwell侵袭实验结果显示:与对照组比较，microRNA-100 mimic组BGC823细胞的增殖、侵袭和迁移能力明显降低，microRNA-100 inhibitor组BGC823细胞的增殖、侵袭和迁移能力明显增强，组间差异有统计学意义(P＜0.05)。 结论:microRNA-100在胃癌患者以及BGC823细胞系中的表达均显著降低，microRNA-100低表达与胃癌淋巴结转移、肿瘤大小、肿瘤分期以及预后密切相关，并促进了BGC823细胞的增殖、侵袭和迁移。microRNA-100低表达是影响胃癌患者预后的独立危险因素。 第二部分:MicroRNA-100调控胃癌细胞生物学功能的分子机制研究 目的:探讨microRNA-100的生物学靶点，分析microRNA-100影响胃癌细胞生物学功能的可能机制。 方法:1.采用生物信息学软件targetscan预测microRNA-100的靶基因，并构建CXCR7-3'UTR-WT和CXCR7-3'UTR-MU双荧光素酶报告质粒载体，双荧光素酶报告实验鉴定CXCR7是否为microRNA-100的作用靶点，并在体外细胞实验中应用RT-PCR方法检测microRNA-100对CXCR7的表达影响;2.应用RT-PCR以及Western-Blot实验方法检测BGC823细胞和GES-1细胞中CXCR7的表达情况;3.采用RT-PCR检测39例胃癌患者癌组织和癌旁组织中CXCR7的表达水平，比较CXCR7在癌组织和癌旁组织的表达差异，并结合临床数据，分析CXCR7表达与胃癌患者临床病理参数的相关性，分析CXCR7表达与患者生存率的关系;4.结合microRNA-100表达水平，分析microRNA-100与CXCR7表达水平的相关性;5.体外恢复实验，应用siRNA技术将CXCR7恢复转染至microRNA-100 inhibitor BGC823细胞系中，然后进行MTT增殖、划痕迁移、transwell侵袭实验，观察恢复CXCR7表达对BGC823细胞增殖、侵袭和迁移功能的影响。 结果:1.双荧光素酶报告基因实验结果显示:空白对照组及阴性对照组中荧光素酶活性无显著变化，而转染microRNA-100 mimic后，CXCR7-3'UTR-WT的荧光报告素酶载体活性显著降低，CXCR7-3UTR-MU荧光报告素酶载体活性无显著变化，组间差异有统计学意义(P＜0.05);2.RT-PCR实验结果显示:与对照组比较，microRNA-100 mimic组BGC823细胞中CXCR7的表达显著降低，microRNA-100inhibitor组BGC823细胞中CXCR7的表达明显升高，组间差异有统计学意义(P＜0.05);3.RT-PCR实验结果显示:与正常胃细胞系GES-1比较，BGC823细胞中CXCR7表达显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。Western-Blot实验结果显示，与正常胃细胞系GES-1比较，BGC823细胞中CXCR7蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01);4.RT-PCR实验结果显示，与癌旁组织比较，CXCR7在胃癌组织中表达上调，差异有统计学意义(P＜0.01)。Pearson相关性分析结果显示:39例胃癌组织中CXCR7与microRNA-100的表达呈负相关(r=-0.923，P=0.000);5.卡方检验以及Pearson相关分析显示:CXCR7表达与淋巴结转移(r=-0.48，P=0.002)，肿瘤大小（r=-0.399，P=0.013）和肿瘤分期（r=-0.332，P=0.038）密切相关。KaplanMeier生存函数分析显示，CXCR7高表达的患者5年总生存率低于CXCR7低表达者，差异有统计学意义(P＜0.05);COX多因素分析显示，CXCR7、肿瘤大小、肿瘤分期以及淋巴结转移是影响胃癌患者预后的独立危险因素;6.应用RNAi技术对BGC823沉默转染CXCR7 siRNA。与miRNA inhibitor组比较，沉默组BGC823细胞中CXCR7表达显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，并接近对照组水平;沉默组BGC823细胞增殖、侵袭和转移能力显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，而与对照组无显著差异。恢复CXCR7表达水平能够逆转microRNA-100对BGC823细胞生物学功能的影响。结果表明microRNA-100调控BGC823细胞系的生物学行为是通过下调CXCR7的表达而完成的。 结论:CXCR7是microRNA-100的下游基因，microRNA-100负性调控CXCR7的表达。胃癌组织以及胃癌细胞中CXCR7呈高表达水平，与microRNA-100表达呈负相关。高表达CXCR7与胃癌患者的淋巴结转移、肿瘤大小、肿瘤分期以及生存率密切相关。恢复CXCR7表达水平能够逆转microRNA-100对BGC823细胞生物学功能的影响。microRNA-100通过下调CXCR7表达调控胃癌细胞的增殖、侵袭、迁移。
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