摘要
本文以Rap1GAP为切入点，对淫羊藿苷干预结肠癌增殖和转移作用和机制进行了初步探讨。 第一部分 Rap1GAP和GALR在结肠腺瘤和结肠癌患者中的表达及临床意义 目的:研究Rap1GAP和三种甘丙肽受体(GALR1、GALR2、GALR3)在结肠癌，结肠腺瘤和正常人组织和粪便中的表达，并分析其与大肠癌病理分型、分化程度等相关临床病理因素的关系。 方法:收集石蜡包埋标本，结肠癌、结肠腺瘤各40例，正常结肠组织13例，收集粪便标本，结肠癌、结肠腺瘤各40例，健康人10例。采用qRT-PCR方法检测Rap1GAP和GALR1、GALR2、GALR3的表达。 结果:大肠粘膜正常组织、腺瘤组织、大肠癌组织中Rap1GAP的表达量依次降低，差异有统计学意义(P＜O.001)。在结肠腺瘤组织中，Rap1GAP的表达与性别、年龄、腺瘤大小无关;与腺瘤病理分型有关，绒毛状腺瘤低于管状腺瘤(P＜0.05);与腺瘤分级有关，高级别瘤变低于低级别瘤变(P＜O.05)。在结肠癌组织中，Rap1GAP的表达与性别、年龄无关、肿瘤大小无关;与肿瘤病理分型有关，在隆起型、溃疡型、浸润型组织中依次降低(P＜O.05);与分化程度有关，在高分化、中分化、低分化组织中的依次降低(P＜0.05);与肿瘤浸润深度有关，TI+T2期高于T3+T4期(P＜0.05);与淋巴结转移有关，无淋巴结转移高于有淋巴转移(P＜O.05);与远处转移有关，无远处转移高于远处转移(P＜0.05)。 GALR1、GALR2、GALR3在正常结肠、结肠腺瘤、结肠癌组织中无显著变化(P＜0.05)。 GALR1、GALR2、GALR3在健康人、结肠腺瘤、结肠癌患者粪便中无显著变化(P＞0.05)。 结论:Rap1GAP的表达水平在正常结肠、结肠腺瘤、结肠癌中逐渐降低，说明其可能参与了结肠细胞的早期瘤变，并且在恶性肿瘤发生发展阶段发挥着抑癌基因的作用，具有一定的临床价值，为结肠癌的早期诊断提供了新的思路。 第二部分 淫羊藿苷抑制荷瘤鼠结肠癌的增殖和转移作用及机制 目的:观察淫羊藿苷对裸鼠皮下移植瘤生长的影响，探讨淫羊藿苷对荷瘤鼠结肠癌生长的抑制作用:观察淫羊藿苷对结肠癌肝转移小鼠肝脏转移的影响，研究淫羊藿苷对荷瘤鼠结肠癌生长和转移的抑制作用。 方法:将对数期的结肠癌HCT116细胞注射在裸鼠皮下，建立裸鼠皮下移植瘤膜型，成瘤后随机分为正常组、对照组(含0.5％生理盐水)、淫羊藿苷低、中、高剂量组(40、80、160mg/kg)，希罗达组(267mg/kg)，灌胃给药。每天观察各组裸鼠的饮食、精神、活动情况，每3天称量体重并测量肿瘤的长短径，绘制体重和肿瘤大小曲线。 结果:成功建立裸鼠皮下移植瘤和小鼠结肠癌肝转移膜型。在皮下移植瘤膜型治疗过程中未发现各组裸鼠饮食、精神、活动情况、体重有显著差异;处死后发现淫羊藿苷呈剂量依赖性抑制了移植瘤的体积和质量(P＜O.05);淫羊藿苷治疗后，Rap1GAP蛋白上调，FAK和ERK蛋白不变，pFAK和pERK蛋白下调，且呈剂量依赖性。在结肠癌肝转移膜型中，淫羊藿苷组小鼠的饮食、精神、活动等情况均好于对照组;处死小鼠后，各组小鼠肝脏均发现转移瘤。与对照组相比，淫羊藿苷组体重、肝重、瘤重均较轻，瘤/肝重比较小，肺和腹膜转移较少，差异有统计学差异(P＜0.05)，该结果表明淫羊藿苷在体内能够抑制结肠癌肝转移，并且呈剂量依赖性;HE染色发现淫羊藿苷能够促进肿瘤组织坏死;免疫组化结果表明淫羊藿苷能够上调Rap1GAP，下调pFAK和pERK。 结论:淫羊藿苷能够抑制荷瘤鼠的生长和转移，并且该作用可能与调控Rap1GAP和FA刚ERK活性有关。 第三部分 Rap1GAP调控FAKfERK途径抑制结肠癌细胞增殖和侵袭、迁移 目的:研究Rap1GAP对结肠癌细胞增殖和侵袭、迁移的影响，探讨是否与FAK/ERK通路有关。 方法:比较Rap1GAP在人正常结肠上皮细胞NCM460、人结肠癌细胞HT29、HCT116、DLD1中的表达;构建慢病毒表达载体pLVPT-Rap1GAP(过表达Rap1GAP)，三质粒系统病毒包装转染293T细胞，收集病毒上清感染HCT116细胞，培养阳性单克隆细胞株;构建PX459-sg-Rap1GAP质粒(敲除Rap1GAP)，转染HT29细胞，培养阳性单克隆细胞株;MTT法检测Rap1GAP对细胞增殖的影响:流式细胞术检测Rap1GAP对细胞周期和凋亡的影响;Transwell实验检测Rap1GAP对细胞侵袭和迁移的影响;Western blot检测FAK、pFAK、ERK、pERK、cyclin D1、cyclin E、MMP9、MMP2蛋白表达;Western blot检测FAK抑制剂Y15和EPAC2激活剂8-CPT-2’-O-Me-cAMP干预HCT116后Rap活性和FAK、ERK等蛋白;Western blot检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂NaB、TSA，DNA甲基化抑制剂5-Aza干预结肠癌细胞后Rap活性和FAK、ERK等蛋白。 结果:成功筛选出HCT116-pLVPT-Rap1GAP单克隆细胞和HT29-PX459-sg-Rap1GAP单克隆细胞。在HCT116-pLVPT-Rap1GAP细胞中，细胞的增殖能力受到明显抑制(P＜O.05)，在HT29-PX459-sg-Rap1GAP细胞中，细胞的增殖能力明显增强(P＜O.05);在HCT116-pLVPT-Rap1GAP细胞中，GO/G1期细胞增多(P＜O.05)，在HT29-PX459-sg.Rap1GAP细胞中，GO/G1期细胞减少(P＜0.05);在HCT116.pLVPT-Rap1GAP细胞中，细胞的侵袭和迁移能力受到明显抑制(P＜O.05)，在HT29-PX459-sg-Rap1GAP细胞中，细胞的侵袭和迁移能力明显增强(P＜O.05);在HCT116-pLVPT-Rap1GAP细胞中，FAK、ERK不变pFAK、pERK、cyclin D1、cyclin E、MMP9、MMP2蛋白下调(P＜O.05)，在HT29-PX459-sg-Rap1GAP细胞中，FAK、ERK不变，pFAK、pERK、cyclin D1、cyclin E、MMP9、MMP2蛋白上调(P＜0.05):8-CPT.2’-O-Me-cAMP作用后，HCT116细胞中Rap2-GTP增加，pFAK、pERK、Cyclin D1、Cyclin E、MMP9、MMP2上调(P＜O.05)，FAK阻断剂Y15完全抑制这种作用。在HCT116和DLD1细胞中，NaB使Rap1GAP上调，Rap2、FAK、ERK不变，Rap2-GTP、pFAK、pERK下调(P＜0.05);TSA也能使Rap1GAP上调(P＜0.05)，5-Aza则无明显作用。在HT29细胞中，用NaB、TSA和5-Aza处理对Rap1GAP表达没有影响。 结论:Rap1GAP抑制结肠癌细胞的增殖和侵袭、迁移，机制可能与Rap1GAP抑制FAK/ERK活化有关。结肠癌细胞HCT116和DLD1中Rap1GAP的表达受乙酰化调节，并且与调节Rap2的活性和ERK/FAK的磷酸化有关。 第四部分 淫羊藿苷通过Rap1GAP介导的脚RK通路抑制结肠癌细胞增殖和侵袭、迁移 目的:研究淫羊藿苷对结肠癌细胞HCT116增殖和侵袭、迁移的影响，并探讨其作用机制是否与调控Rap1GAP介导的FAK/ERK通路有关。 方法:不同浓度的淫羊藿苷(5、10、15、20、25μmol/L)作用于对数生长期的HCT116细胞，采用MTT法检测淫羊藿苷对结肠癌细胞HCT116的增殖影响;通过Transwell侵袭实验和迁移实验比较淫羊藿苷对结肠癌细胞HCT116侵袭和迁移影响:流式细胞技术检测淫羊藿苷对结肠癌细胞HCT116凋亡和周期的影响:qRT-PCR检测淫羊藿苷对结肠癌细胞HCT116中Rap1GAP的mRNA的影响;Western blot方法检测淫羊藿苷对结肠癌细胞HCT116中Rap1GAP，FAK、pFAK、ERK，pERK，cyclin D1，cyclin E、MMP9、MMP2蛋白表达的影响。 结果:不同浓度的淫羊藿苷对HCT116细胞的增殖能力有明显抑制作用(P＜0.05)，一定范围内具有时间剂量依赖性，作用于HCT116细胞24h，489，72h的半数抑制浓度(IC50)为21.04gmol/L，18.809mol/L，17.26μmol/L:淫羊藿苷对HCT116细胞的侵袭和迁移能力有明显抑制作用(P＜O.05)，并且呈浓度依赖性;淫羊藿苷能够诱导HCT116细胞发生凋亡(P＜O.05)，并且呈浓度依赖性:淫羊藿苷作用后G0/G1期的HCT116细胞百分比升高(P＜0.05)，并且呈浓度依赖性;HCT116细胞中Rap1GAP的mRNA和蛋白质水平上调，FAK、ERK蛋白不变，pFAK、pERK、cyclin D1、cyclin E、MMP9、MMP2蛋白水平下调(P＜0.05)。 结论:淫羊藿苷能够抑制结肠癌细胞HCT116的增殖和侵袭能力，其机制可能与作用Rap1GAP调控FAK/ERK通路有关。
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