摘要
菊花(Chrysanthemum morflorium Ramat)原产中国。是菊科菊属多年生宿根草本花卉，作为我国十大传统名花和世界四大切花之一，以其重要的茶用、药用和食用的功能而深受大众喜爱，其因花色丰富、花型多样，在现代花卉生产中占据重要的地位。miR156由于功能多样，被称之为全能小RNA，近年来随着对miR156的研究逐步深入，发现其在植物的年龄途径、开花途径、花色形成和逆境胁迫等多个过程发挥着重要作用。另外，miR156靶基因SPL家族基因功能广泛，该家族成员不仅能够调控植物形态建成和花期，还可以响应逆境胁迫，而菊花中miR156靶基因的具体功能尚未见报道。本研究开展了miR156靶基因CmSPLs基因的鉴定，并通过遗传转化拟南芥初步明确了其功能，通过对Small RNA-Seq、miR156及其靶基因表达定量分析，探讨了miR156及其靶基因与菊花花色形成的相关性。主要研究结果如下: 1.本研究以菊花‘神马’为材料。对本实验室已克隆的‘神马’SPL转录因子家族的12个成员进行miR156靶基因识别剪切预测，进一步借助5'RLM-RACE技术确定了CmSPL3、CmSPL10受miR156的剪切调控。除了常见的miR156在10-11位对CmSPL3、10剪切外，还存在其他位置的剪切。组织定量结果显示，CmSPL3在菊花根中的表达量最高，舌状花中表达量最低;CmSPL10在菊花的管状花中表达量最高，舌状花中表达量最低。酵母单杂交实验结果验证，CmSPL3具有转录激活活性，CmSPL10无转录激活活性。亚细胞定位实验结果显示，CmSPL3、10基因所编码的蛋白均定位于细胞核上。上述发现为进一步研究CmSPLs基因的功能奠定了基础。 2.35AA-SRDX-rCmSPL3超表达转基因拟南芥T3代比野生型开花提前2.8天，莲座叶数目少于野生型4.64片，表皮毛出现的叶位数也相对野生型提前2.65片，开花促进基因表达量高于野生型。35AA-SRDX-rCmSPL10超表达转基因拟南芥T3开花比野生型提前1.81天，莲座叶数目要少于野生型2.86片，表皮毛出现的叶位数比野生型提前1.67片，开花促进基因如FT、SOC1、AP1、LFY和FUL表达量也相对野生型上调。说明CmSPL3、CmSPL10的超表达转基因植株营养生长期向生殖期的阶段转换均得到了提前。 3.通过HPLC-MS技术对双色菊花‘南农胭脂莓’粉色花瓣、白色花瓣部位花青苷及类黄酮进行了定量定性分析，发现白色、粉色花瓣的类黄酮的总含量并没有显著差异，但白色花瓣部位不含花青素，而粉色花瓣部位含有两种花青素苷，且都属于矢车菊素类。通过实验室前期的Small RNA-Seq数据分析，发掘了‘南农胭脂莓’粉色和白色部位差异表达的miRNAs，其中miR156在粉色花瓣部位显著上调。为了更进一步探究miR156对花色形成的影响，以粉色花‘南农绯玉’花色着色四个不同发育时期的花瓣为样品，对miR156和靶基因进行定量分析，发现随着花色着色进程的推进，miR156的表达量逐渐上升，说明其在花瓣呈色过程中发挥着一定的作用。为进一步开展miR156及其靶基因与双色花着色的相关性，对粉白复色品种不同时期、不同着色部位进行miR156定量分析，发现‘南农胭脂莓’、‘南农雅莓’、‘南农花脸’不同时期粉色花瓣部位的miR156表达量都要高于白色花瓣部位。通过靶基因定量分析，发现‘南农胭脂莓’中CmSPL3、CmSPL10参与前两个时期的双色花花色形成，而未参与第Ⅲ、第Ⅳ时期的花色形成，推测存在其他SPLs靶基因参与花色形成。‘南农雅莓’、‘南农花脸’中，CmSPL3基因可能也参与其花色调控:CmSPL10仅参与前两个时期的花色形成进程，可能存在其他SPLs靶基因参与第Ⅲ时期、第Ⅳ时期的花色形成。对红黄复色品种不同时期、不同着色部位进行miR156定量分析，发现在红黄双色花品种‘南农炫金’、‘南农火炬’、‘南农勋章’中，红色花瓣部位的miR156表达量高于黄色花瓣部位。靶基因定量分析发现，‘南农炫金’中CmSPL3基因参与双色花花色形成，CmSPL10并未参与双色花的花色形成，可能存在其他SPLs靶基因在起作用。‘南农火炬’中，CmSPL3、CmSPL10并非参与花色形成的主要调控基因，可能存在其他靶基因SPLs的参与。同样，‘南农勋章’中，CmSPL3基因参与双色花的花色形成，CmSPL10仅参与前两个时期的花色形成进程，可能也存在其他靶基因SPLs参与第Ⅲ时期、第Ⅳ时期的花色形成。
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