摘要
燃料乙醇是重要的液体生物燃料，当前主要以玉米、甘蔗为原料发酵生产，称为一代燃料乙醇。与之相比，利用农业废弃物、能源植物等木质纤维素类生物质为原料的二代燃料乙醇生产过程，具有维护粮食安全、原料可持续且便宜和温室气体排放少的优势。 组合代谢工程策略，包括表达异源的木糖和阿拉伯糖分解代谢途径、增强木酮糖激酶和非氧化戊糖磷酸途径及适应性进化工程已构建出能利用木质纤维素水解液中葡萄糖和戍糖的酿酒酵母菌株。但现有戊糖酵母往往在葡萄糖耗尽后才开始利用木糖和阿拉伯糖，这限制了纤维素乙醇经济性生产。此前研究表明由内源性己糖转运蛋白介导的戊糖转运和胞内代谢过程均受到葡萄糖抑制。在戊糖酵母中引入对葡萄糖不敏感的戊糖转运蛋白和改造能弱化胞内葡萄糖效应的靶点，仍未在工业糖浓度水平实现葡萄糖和戊糖的高效共发酵。推测这些菌株转运戊糖的特异性和效率有待提升才能与葡萄糖相竞争，同时胞内戊糖代谢亦需要更加精细的调控。本论文目的是揭示酿酒酵母同步利用葡萄糖和戊糖的限制因素。 首先，通过将葡萄糖磷酸化缺陷的木糖酵母菌株CIBTS1992在木糖和逐渐增加葡萄糖浓度的混合糖中适应性进化，获得葡萄糖存在下木糖发酵改善的进化菌株CIBTS2021。基因组重测序和反向遗传重构表明进化菌株中己糖转运蛋白突变体Hxt3-T210I-N367S是缓解葡萄糖抑制的首要因素，且T210I和N367S有协同效应。但对未进化菌株的Hxt3修改后，其厌氧木糖发酵能力不及进化菌株，提示还存在其他有益于厌氧木糖代谢的遗传变化。然后，将回补葡萄糖激酶和己糖激酶的进化菌株在80g/l葡萄糖和40g/l木糖混合糖中进行厌氧批次发酵，与对照菌株比，能部分改善葡萄糖和木糖同步代谢，但由于葡萄糖及葡萄糖耗尽后木糖消耗速率降低，并未改善乙醇生产效率。 同上策略，通过将葡萄糖磷酸化缺陷的木糖和阿拉伯糖共发酵酵母菌株CIBTS2017在逐渐增强的葡萄糖压力下适应性进化，获得能耐受80g/l葡萄糖利用阿拉伯糖的进化菌株CIBTS2020，而未进化菌株被5g/l葡萄糖的严格抑制。基因组重测序和反向遗传重构发现进化菌株带有半乳糖转运蛋白突变体Gal2-N376T，其表达可使未进化菌株在葡萄糖和阿拉伯糖混合糖中经过至少5天延滞期生长。分别参考延滞生长菌株和进化菌株，将未进化菌株中Ras/cAMP/PKA途径的Ras蛋白乌苷酸交换因子Cdc25移码失活或引入R1411Q突变可消除生长延滞期。随后，恢复葡萄糖代谢的进化菌株在80g/l葡萄糖、40g/l木糖和20g/l阿拉伯糖中厌氧批次发酵，与对照菌株比，阿拉伯糖利用几乎不受葡萄糖抑制。总糖消耗时间由28h缩短至24h，乙醇生产强度由0.159g/g DCW/h提高至0.173g/g DCW/h，同时具有高乙醇滴度和产率。 此外，构建了同时缺陷阿拉伯糖吸收和葡萄糖磷酸化的戊糖酵母菌株CIBTS2026，将其作为葡萄糖不敏感的阿拉伯糖转运蛋白筛选和进化平台，并在2周内鉴定到优于Gal2-N376T的突变体。 本论文通过葡萄糖分解代谢缺陷戊糖酵母的进化工程和反向遗传重构揭示了己糖转运蛋白和Ras/cAMP/PKA途径扰动对缓解葡萄糖抑制的贡献，并构建了改善葡萄糖和戊糖共发酵的工程酵母。进一步菌株优化依赖于高效戊糖转运蛋白的鉴定及对葡萄糖抑制机制的深入解析。
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