摘要
蛋白质不仅是组成机体一切细胞、组织的基本有机物，而且是动物日粮中的重要能源物质，它与碳水化合物和脂肪等营养素共同维持机体的生长与代谢。此外，蛋白质在胃肠道降解产生的氨基酸及多肽是胃肠道重要的信号分子，氨基酸能被肠内分泌细胞上的氨基酸感应体感应，从而影响胃肠细胞的增殖分化、胃肠激素的分泌及营养物质的吸收，调控摄食及血糖代谢等。钙离子敏感受体(Calcium sensingreceptor，CaSR)是已知的氨基酸感应体，在十二指肠的K细胞和I细胞等多种胃肠内分泌细胞中有表达。近年有研究表明，精氨酸、芳香族氨基酸等能激活小肠中的CaSR，调节葡萄糖促胰岛索肽(glucose-dependent insulinotropic peptide，GIP)、胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide1，GLP-1)、及胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)等胃肠激素分泌，从而调节机体食欲及血糖平衡。然而目前关于氨基酸调节胃肠道CaSR表达及功能的研究主要集中在人和啮齿动物上。对猪及家畜动物的研究鲜有报道。本论文结合体外表面灌流和体内动物试验，对精氨酸(L-Arg)是否可以促进猪小肠胃肠激素分泌，CaSR是否可以参与介导精氨酸引起的效应，精氨酸是否可以通过调节激素分泌影响机体采食等问题展开研究。 1.CaSR及其下游信号分子介导L-Arg调控猪十二指肠胃肠激素分泌的规律及机制 本试验选择猪十二指肠为研究对象，采用体外表面灌流系统，分别灌流不同浓度的精氨酸、细胞外钙离子、CaSR抑制剂及激活剂、CaSR下游信号点腺苷酸环化酶(AC)及磷脂酶C(PLC)抑制剂，收集灌流液测定胆囊收缩素(CCK)和葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)的浓度，探究CaSR及其下游信号分子是否参与介导L-Arg调控猪十二指肠CCK和GIP的分泌。结果表明。20mM和50mML-Arg可以显著引起CCK和GIP的分泌(P＜0.05)，然而D-Arg(无活性异构体)对CCK和GIP的分泌没有显著影响(P＞0.05)。CaSR的天然配体Ca2+和CaSR激动剂cinacalcet可以进一步促进L-Arg诱导CCK和GIP的分泌(P＜0.05)。但是，加入CaSR特异性抑制剂NPS2143和Calhex231后显著抑制了L-Arg诱导的CCK和GP的分泌(P＜0.05);此外，抑制CaSR下游信号分子AC和PLC，CCK和GⅢ的分泌减弱(P＜0.05)。综上所述，精氨酸可以促进猪十二指肠CCK和GIP的分泌，且这种促分泌作用可能是通过激活CaSR及其下游信号分子AC和PLC实现的。 2.CaSR基因在大鼠不同组织部位的相对表达差异 体外灌流精氨酸可以通过CaSR调节胃肠激素的分泌。然而体内环境复杂多变，Arg诱导的这种促分泌作用在体内是否存在，是否通过CaSR介导还有待进一步探究。基于猪成本高，操作较复杂，本研究利用大鼠对以上问题进行探究。首先我们检测了大鼠体内不同组织部位CaSR的表达，为体内研究L-Arg对大鼠胃肠道CaSR表达、胃肠激素分泌及采食的影响奠定基础。试验随机选取7周龄左右的雌性及雄性SD大鼠各5只。采用实时荧光定量PCR技术检测CaSR基因在大鼠胃肠道(胃、十二指肠、空肠、回肠)、代谢器官(肝脏，肾脏)及生殖器官(睾丸、附睾、子宫、卵巢)的相对表达量。结果表明:CaSR在检测的十种组织均有表达。在胃肠道，胃CaSR基因表达量显著高于其它肠段(P＜0.05):在代谢器官，肾脏CaSR基因表达量显著高于肝脏(P＜0.05)在生殖器官，睾丸CaSR基因的表达量显著高于附睾(P＜0.05)。子宫与卵巢的表达量较低，且二者无显著差异(P＞0.05)。结论:CaSR基因在雌性、雄性大鼠的胃肠道、代谢器官以及生殖器官组织中均有表达，且在各组织间的表达差异显著。 3.L-Arg对大鼠胃肠激素分泌及食欲的影响 基于之前的试验结果，该部分重点探究L-精氨酸(L-Arg)对大鼠胃肠激素分泌，胃肠道钙敏感受体(Calcium-sensing receptor，CaSR)基因表达及采食的影响，为将来研究L-Arg对猪采食及胃肠激素分泌的影响奠定基础。本文分为两个试验。试验I，选择32只SD雄性大鼠并随机分为四组，即对照组(灌胃0mmol·kg-1L-Arg·HCI)、低剂量组(5mmol·kg～L-Arg·HCI)、中剂量组(10mmol·kg-1L-Arg·HCI)和高剂量组(20mmol·kg-1L-Arg·HCI)。每只鼠灌胃总体积2.5mL，记录灌胃后0-1、1-2、2-4及0-24h内大鼠的采食量。探究L-Arg对采食的短期影响，根据采食量结果筛选出对大鼠采食影响显著的L-Arg最适剂量，用于试验Ⅱ。试验Ⅱ，另选30只雄性大鼠随机分为两组，分别为:对照组(灌胃生理盐水)以及试验Ⅰ筛选出的最适L-Arg组(灌胃20mmol·kg-1)，持续灌胃大鼠一周(每天一次)，在此期间记录大鼠初始体重、终体重及日采食量。试验结束后采血，检测胃肠激素;采集胃、十二指肠、空肠及回肠中段组织检测CaSR的基因表达;采集下丘脑组织检测厌食因子POMC及促食因子NPY的基因表达。结果显示:试验Ⅰ，10mmol·kg-1及20mmol·kg-1的L-Arg·HCI在灌胃后的0-1h以及0-24h显著降低大鼠采食(P＜0.05)，其中20mmol·kg-1效果最显著;试验Ⅱ，与对照组相比，20mmol·kg-1L-Arg·HCI显著降低了大鼠体增重及前两天的累加采食量(P＜0.05)，促进了胃肠道CaSR、厌食因子POMC基因表达和胆囊收缩素(CCK)分泌(P＜0.05)，胃泌素(Gastrin)及葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)的分泌虽有增加但差异不显著。相关分析结果显示，血清中CCK浓度与十二指肠、空肠CaSR及下丘脑POMC基因表达量呈显著正相关(P＜0.05):GIP浓度与十二指肠CaSR及下丘脑POMC基因表达量呈显著正相关(P＜0.05):GLP-1浓度与空肠CaSR及下丘脑POMC基因表达量有显著正相关的趋势(0.05＜P＜0.1)。说明，L-Arg可能上调CaSR基因表达影响胃肠激素分泌，进而引起大鼠厌食反应。
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