摘要
本研究将大菱鲆放养于高、中、低三个密度组(HD,MD，LD)，经接种减毒迟钝爱德华氏菌活疫苗后，利用酶联免疫、流式细胞仪术、现代分子生物学等技术手段。监测大菱鲆免疫相关因子的变化，基因的表达规律，阳性B细胞的动力学特征，并通过构建关键免疫器官比较转录组，分析拥挤胁迫对大菱鲆免疫应答的影响。主要研究结果和内容如下: 1.拥挤胁迫对大菱鲆血液生理参数及免疫基因表达的影响 通过监测不同养殖密度组(LD∶5kg/m2，MD∶10kg/m2，HD∶20kg/m2)中，接种疫苗大菱鲆的(Scophthalmus maximus)血液、脾脏、头肾、鳃和皮肤中免疫指标变化规律。研究经接种疫苗操作后大菱鲆应对拥挤胁迫的应激响应。结果显示:血液中，LD组大菱鲆白细胞介素(1L-1β)、补体(C3)、免疫球蛋白M(IgM)、溶菌酶(LZM)和肿瘤坏死因子(TNF-α)等免疫指标显著高于MD、HD组(P＜0.05)，通过基因表达分析发现LD组大菱鲆鳃组织中的主要组织相容性复合体(MHCⅡ)表达量显著高于MD、HD组(除了免疫后第三周);LD组鳃中的IL1β表达量也高于MD、HD密度组;LD组皮肤中TNF-α的表达量高于MD、HD同组织中的含量。 2.拥挤胁迫对大菱鲆特异性免疫应答的影响 通过监测不同养殖密度下大菱鲆阳性B淋巴细胞，特异性抗体IgM以及皮质醇含量的变化，研究拥挤胁迫对大菱鲆特异性免疫应答的影响。接种疫苗后，用流式细胞术检测大菱鲆血液，脾脏以及头肾中阳性免疫球蛋白(sIg+)的含量，结果表明，HD组sIg+细胞含量在免疫后第六周达到峰值，比低密度组和HD组峰值出现时间晚了一周。另外HD组大菱鲆在血液、脾脏和头肾中的sIg+细胞含量高峰值(血液41.37±3.18％，脾脏29.6±2.34％，头肾22.37±1.76％)显著低于MD(血液46.73±3.18％.脾脏33.28±2.68％，头肾24.57±2.32％，P＜0.05)和LD(血液53.14±3.25％。脾脏38.36±3.54％，头肾28.13±3.456％,P＜0.05)。同时所有实验组大菱鲆特异性抗体含量在免疫后均开始上升，LD和MD在免疫后第5周达到峰值。而HD组的特异性抗体在第6周达到峰值。HD组皮质醇含量在最后3.4周时间里远高于MD和LD。整个结果表明，在低密度养殖条件下大菱鲆能够获得更好的免疫效果。同时我们发现HD组大菱鲆对于接下来的免疫刺激的反应能力有所下降。 3.大菱鲆脾脏转录组数据分析 为系统了解拥挤胁迫对大菱鲆免疫应答影响的转录组特征，我们选取了HD组和LD免疫后第5周的脾脏，共构建了6个cDNA测序文库，进行了RNA-seq测序及生物信息学分析。测序共得到447，000，000条平均长度为1274bp的序列。经过小片段去除和质量筛查后，共获得94％的高质量序列。这些高质量的序列经过拼接得到41，136unigenes。 将得到的41136条Unigenes与NCBI的Nr经blast比对，其中22806条获得同源序列注释，占总数的55.44％，再将全部获得序列依次与Swissprot、KOG和KEGG数据库进行比对。经四大数据库比对后，共有2293l条Unigenes获得了注释.占总数的55.74％。为了进一步了解转录组数据的完整性，对获得的41136个Unigenes进行了COG功能注释。41136条Unigenes被注释到26个不同功能家族中.经比对发现涉及Signal transduction mechannisms功能的基因最多有7901条Unigenes，其次是General function prediction only功能有6112条Unigenes，然后Posttranslation modification功能有3216条Unigenes涉及为了进一步对Unigenes描述，对于获得的Unigenes进行GO注释。41136条Unigenes被注释到GO数据库中细胞组分、生物学过程和分子功能三大类55个分类中。其中生物学过程占了23类，细胞组分占了20类，分子功能占了12类。在生物学过程中关于cellular process Unigenes最多为6462条，占15.7％。细胞组分中cell和cell part均占4630条Unigenes，占总的11.3％。分子功能中bing类有7120条Unigenes，占比最多为17.3％。 利用RPKA值差异显著性(P＜0.05)计算两组基因表达量，并用2-fold法进行数据统计和分析不同密度组之间的差异基因。总共获得397个差异表达基因，其中146个基因显著上调，251个基因显著下调。对大菱鲆脾脏转录组的测序，将有助于大菱鲆免疫组学相关研究工作的开展。 4.大菱鲆头肾差异表达基因转录组数据分析 经转录组测序后，将各样品所获得的原始reads数据进行过滤，首先去除带接头(adopter)的reads。然后去掉无法确定碱基信息占比超过10％的reads，最后去掉低质量的reads得到clean reads。将clean reads进行拼接组装，HD组获得40762条unigenes，LD40843条unigenes。以LDunigenes作为基准，利用RPKA值差异显著性(P＜0.05)计算HD组基因表达量。并用2-fold法进行数据统计和分析。总共获得758个差异表达基因。其中100个基因显著上调，658个基因显著下调，下调基因远高于上调基因数。 将所有差异表达基因进行GO分析，这些基因分属于生物过程、细胞组分和分子功能三大类下的42个分支，且均以下调为主。生物过程组中含有19个分支，其中细胞过程(cellular process)、单组织过程(single-organism process)和代谢过程(metabolic process)占比最高分别为23.48％，20.32％和17.94％;细胞组分组中有13个分支。其中细胞(cell)、细胞组分(cell part)和细胞器(organelle)占比最高，分别为15.17％，15.17％和11.74％;在分子功能分组中有10个分支，其中结合(binding)、催化活性(catalytic activity)和分子传导活性(molecular transducer activity)占比最高。分别为30.21％。18.47％和3.43％。差异表达基因的GO功能富集分析表明，拥挤胁迫下鱼体代谢和生物调控机能受到影响。 通过KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路注释分析有助于我们了解基因产物、生物学功能、代谢途径以及酶催化之间的联系。把差异表达基因序列与KEGG数据库中的数据进行blastx比对注释。结果表明758个差异表达基因涉及KEGG新陈代谢(Metabolism)。遗传信息加工(Genetic Information Processing)。环境信息加工(Environmental Information Processing)，细胞过程(CellularProcesses)以及生物体系统(Organismal Systems)五大类的125个通路。其中p＜0.05的显著差异通路有血管平滑肌收缩(Vascular smooth muscle contraction)、cGMP-PKN信号通路(cGMP.PKG signaling pathway)、Rapl信号通路(Rapl signaling pathway)等14条通路，p＜0.01的极显著差异通路有6条分别为焦点粘连(focal adhesion)，黏着连接(adherens iunction)，FoxO信号通路(FoxO signaling pathway)，黑色素生成(Melanogenesis)，ErbB信号通路(ErbB signaling pathway)以及刺猬信号通路(Hedgehog signaling pathway)。对大菱鲆脾脏转录组的测序，将有助于大菱鲆免疫组学相关研究工作的开展。 5.大菱鲆IL-4/13的鉴定与表达分析 通过RT-PCR技术以及RACE技术获得IL-4/13基因的全长cDNA1333bp，开放阅读框435bp，编码144个氨基酸，其中前端21个氨基酸经SignalP4.1预测为信号肽，其余的123个氨基酸为成熟肽。构建进化树，结果表明大菱鲆IL4/13基因与鲈鱼的IL-4/13-2基因聚为一枝。设计荧光定量PCR引物在大菱鲆心、脾、肠、头肾、皮、肌、脑、肝及鳃中进行表达，发现在心、脾、肠和头肾中表达量较高。免疫注射发现，在免疫后各组织中表达含量均明显上升，说明IL-4/13在大菱鲆免疫应答中起重要作用;但是在不同密度组之间，各相同组织中表达量没有显著差异，说明拥挤胁迫对IL-4/13基因的表达没有显著影响。大菱鲆IL-4/13基因的获得为大菱鲆免疫的研究提供了一定的基础信息支持。
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